張開雪 ，鄔 蘭 ，韓宗賢 ，鹿江南 ，馬 偉 ，熊超，丁丹丹，陳士林＊＊

（1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 哈爾濱 150040；3. 武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院 武漢 430070；4. 江陰天江藥業(yè)有限公司 無錫 214434）

紫蘇葉來源為唇形科紫蘇Perilla frutescens(L.)Britt.的干燥葉（或帶嫩枝）[1]，出自《名醫(yī)別錄》，并被列為中品。除了葉，紫蘇的果實(shí)和莖也可入藥。紫蘇具有強(qiáng)生命力，對環(huán)境要求不高，全國分布廣泛，種植歷史已超2000年，在日本、韓國、印度、美國、加拿大等國家也有分布，而且很多地區(qū)已實(shí)現(xiàn)了大范圍的商業(yè)栽培。

目前，由于其富含獨(dú)特的活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分，紫蘇已經(jīng)成為一種全世界人民關(guān)注的焦點(diǎn)植物。紫蘇葉是臨床上使用頻率較多的中藥，同時(shí)它也常被作為蔬菜食用，含有多種維生素及礦物質(zhì)。另外，紫蘇葉中還含有揮發(fā)油，相關(guān)研究證明揮發(fā)油具有抗癌、抗氧化、抗菌等作用[1-4]。如今，紫蘇葉揮發(fā)油不僅在醫(yī)藥、食品行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，而且在化妝品、營養(yǎng)保健、工業(yè)用油、香料工業(yè)等方面也取得了一定的成績，具有很高的開發(fā)價(jià)值和利用價(jià)值[3,5]?！吨袊幍洹?015年版也把紫蘇葉揮發(fā)油含量作為藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)。截止到今天，類似于紫蘇葉揮發(fā)油的研究已經(jīng)有了大量的文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，但是與紫蘇葉水提液相關(guān)的研究報(bào)道并不常見。湯劑是我國古代最傳統(tǒng)的、最常用的且應(yīng)用最廣泛的一種用藥方式，臨床上治療疾病也多用湯劑。標(biāo)準(zhǔn)湯劑的引入有利于臨床用藥的準(zhǔn)確性和劑量的統(tǒng)一性，改變目前的監(jiān)管困局，改善管理水平，保障臨床療效，促進(jìn)用藥質(zhì)量的提高，促進(jìn)制造工藝的提升，為中藥研究的標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)[8-11]。因此，開展紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評價(jià)方法的研究是有必要的。本文以17批紫蘇葉為原料，參考含揮發(fā)油飲片桂枝[12]、姜黃[13]、肉桂[14]的標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究，按照統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)制備紫蘇葉飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以紫蘇葉揮發(fā)油的含量為指標(biāo)，確定轉(zhuǎn)移率和出膏率的范圍，測定pH 值，并通過HPLC 法建立紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜分析方法，尋找最適合紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的定量指標(biāo)成分，為紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考數(shù)據(jù)。

表1 紫蘇葉樣品信息

1 材料

1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國）有限公司）；Sartorius-BP211D 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；YP6001型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；FE20 型pH 計(jì)（瑞士METTLER-TOLEDO 公司）；Scanspeed mini 型高速離心機(jī)（丹麥Labogene公司）。

樣品來自5 個(gè)地區(qū)，分別為江蘇、河北、江西、河南和浙江，共計(jì)17批。經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所孫偉副研究員鑒定和DNA 條形碼實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所有樣品均為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens(L.) Britt（.表1）?？Х人釋φ掌罚ㄅ朚UST-17032010，含量 ≥99.48%），迷迭香酸對照品（批號MUST-17040532，含量 ≥99.40%），野黃芩苷對照品（批號MUST-17030406，含量≥98.74%），且以上對照品全部從成都曼思特生物科技有限公司購買。實(shí)驗(yàn)中所用乙腈為色譜純（Thermo Fisher公司），水為超純水，其它試劑均為分析純。

表2 紫蘇葉揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果（）

表2 紫蘇葉揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果（）

images/BZ_22_349_1572_437_1609.png/%87.20±11.84編號ZSY-01 ZSY-02 ZSY-03 ZSY-04 ZSY-05 ZSY-06 ZSY-07 ZSY-08 ZSY-09 ZSY-10 ZSY-11 ZSY-12 ZSY-13 ZSY-14 ZSY-15 ZSY-16 ZSY-17飲片中揮發(fā)油含量/%（mL·g-1）1.00 1.00 1.00 0.30 0.40 0.40 0.80 1.20 0.50 0.80 0.60 0.50 0.30 0.80 0.80 0.90 1.00標(biāo)準(zhǔn)湯劑中揮發(fā)油含量/%（mL·g-1）1.00 0.80 0.80 0.30 0.40 0.40 0.70 1.00 0.40 0.50 0.60 0.40 0.30 0.75 0.70 0.70 0.70轉(zhuǎn)移率/%100.00 80.00 80.00 100.00 100.00 100.00 87.50 83.30 80.00 62.50 100.00 80.00 100.00 93.75 87.50 77.78 70.00

2 方法與結(jié)果

2.1 定量測定

2.1.1 供試品溶液的制備

（1）飲片供試品溶液制備

根據(jù)《中國藥典》2015 年版揮發(fā)油測定法（通則2204）測定，取 ZSY-01 至 ZSY-17 紫蘇葉飲片適量，保持微沸2.5 h，即得。

（2）標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液制備

參照含揮發(fā)油飲片桂枝[12]、姜黃[13]、肉桂[14]的標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝，結(jié)合陳士林老師2016 年發(fā)表的“中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略”一文中對于花葉類飲片制備方法的敘述，最終確定具體提取工藝如下。稱100 g紫蘇葉，置圓底燒瓶中，加12 倍量水浸泡30 min，在揮發(fā)油提取器中提取2 h，得揮發(fā)油，提取液過濾；向余下的殘?jiān)性偌尤?0倍量水，在揮發(fā)油提取器中繼續(xù)提取30 min，得揮發(fā)油，提取液過濾。將兩次得到的揮發(fā)油合并、提取液合并，待提取液濃縮至適量后，再將揮發(fā)油加入其中，定容至500 mL，即得標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液。

2.1.2 測定法

分別測定飲片供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液中所得揮發(fā)油的量（表2）。

表3 紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH值及出膏率

2.2 轉(zhuǎn)移率和出膏率

2.2.1 揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率

基于飲片中揮發(fā)油的含量測定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中揮發(fā)油的含量測定結(jié)果，計(jì)算紫蘇葉的揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率（表2）：轉(zhuǎn)移率（%）= W·M-1*100%，W 表示湯劑中揮發(fā)油的量（mL），M 表示飲片中揮發(fā)油的量（mL）。揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率范圍為62.50%-100.00%，平均值為87.20，RSD值為13.58%。

2.2.2 出膏率

取干燥至恒重的蒸發(fā)皿，精密加入“2.1.1（2）”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液各25 mL，平行兩份，水浴蒸干，在105℃烘箱中干燥3 h，移置干燥器中，冷卻30 min，稱重，計(jì)算得到紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率，其中出膏率范圍為14.50%-24.80%（表3）。

2.3 pH值測定

取“2.1.1（2）”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液適量，用pH 計(jì)測定 pH 值，得到 pH 范圍在 4.70-5.25 之間，平均值為4.90，RSD值為2.7%，波動不大（表3）。

2.4 紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Aligent-Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）。流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫條件：0-50 min，12%-19%B；50-60 min，19-22% B。柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：325 nm。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備

精密量取紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液0.8 mL和水0.8 mL，置于同一離心管中，混勻，12000 rpm離心5 min，取上清液用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 對照品溶液制備

取咖啡酸、野黃芩苷和迷迭香酸對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成濃度均為20 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.4.4 測定法

精密吸取17批次的標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液各10 μL、混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

2.4.5 方法學(xué)驗(yàn)證

（1）精密度實(shí)驗(yàn)

取批號為ZSY-01 的樣品制備的紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以7號峰作為參照峰，對主要共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間進(jìn)行測定。結(jié)果表明RSD 均＜2%，表明儀器精密度良好。

（2）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取批號為ZSY-01 的樣品平行制備6 份紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以7號峰作為參照峰，對主要共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間進(jìn)行測定。其結(jié)果顯示RSD 均＜2%，表明本方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號為ZSY-01 的樣品制備紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)行測定，按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以7 號峰作為參照峰，對主要共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間進(jìn)行測定。結(jié)果顯示RSD 均＜2%，表明紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定

精密吸取17批次的紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰信息（見圖1）。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”軟件對所得到的17 批指紋圖譜進(jìn)行分析，生成對照指紋圖譜，結(jié)果表明17批紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜與對照指紋圖譜間相似度均超過0.8（表4），發(fā)現(xiàn)共有峰有7 個(gè)，通過對照品指認(rèn)出3 個(gè)共有峰，其中 1 號峰：咖啡酸，6 號峰：野黃芩苷，7 號峰：迷迭香酸，以7 號峰作為參照峰，得到7 個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積（表5）。

圖1 17批紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜

2.4.7 標(biāo)準(zhǔn)湯劑中共有峰的含量測定

根據(jù)2.4.4 項(xiàng)下測定結(jié)果，得到17 批紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸含量范圍為53.71-209.85 μg·mL-1，野黃芩苷的含量范圍為144.62-1985.16 μg·mL-1，迷迭香酸的含量范圍為121.08-1465.46 μg·mL-1（表6）。

2.5 紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑中定量指標(biāo)成分探討

《中國藥典》2015 年版紫蘇葉飲片項(xiàng)下僅規(guī)定了揮發(fā)油的含量，并沒有規(guī)定某一種確定的指標(biāo)成分，因此需要尋找適合紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指標(biāo)成分來用于定量研究。基于此，對指紋圖譜中已指認(rèn)的三個(gè)共有峰通過對照品進(jìn)行初步定量計(jì)算，本研究中選擇迷迭香酸作為定量控制指標(biāo)成分，所研究的17批紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑中迷迭香酸含量為121.08-1465.46 μg·mL-1，可用于紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑定量控制。

3 討論

《中國藥典》2015 年版收載了紫蘇子、紫蘇梗和紫蘇葉三種藥材，它們的來源均為唇形科植物紫蘇，只是取自其原植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的三個(gè)不同藥用部位，分別為果實(shí)、莖、葉。當(dāng)中還規(guī)定迷迭香酸是紫蘇子藥材、飲片和紫蘇梗藥材的指標(biāo)成分；紫蘇葉藥材和飲片都規(guī)定了揮發(fā)油含量限定，沒有規(guī)定具體的指標(biāo)成分。對于紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑僅以揮發(fā)油含量作為是否合格的標(biāo)準(zhǔn)較為單一，缺乏對其主要成分的定性分析，所以本文對紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜進(jìn)行研究并指認(rèn)了部分共有峰。以特征峰個(gè)數(shù)多和峰形好為依據(jù)，通過DAD 全波長掃描實(shí)驗(yàn)，最終確定指紋圖譜檢測波長為325 nm，并在此波長下指認(rèn)出3 個(gè)成分：咖啡酸，野黃芩苷，迷迭香酸。迷迭香酸是藥典規(guī)定的紫蘇子藥材和飲片以及紫蘇梗藥材的質(zhì)控指標(biāo)，并不是紫蘇葉所特有的成分，在其他藥材，如夏枯草和薄荷中也含有迷迭香酸這一成分，因此是否選擇迷迭香酸作為紫蘇葉的質(zhì)控指標(biāo)是需要討論的。由于迷迭香酸在紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑中含量相對較高，穩(wěn)定性佳，也是其發(fā)揮藥效的活性成分[4]，因此暫定為紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制指標(biāo)成分。待未來進(jìn)行更深入的研究后可建議增加新的指標(biāo)成分，如指紋圖譜中的其他成分如野黃芩苷等。

表4 17批紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度匹配

表5 紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰的相對保留時(shí)間與相對峰面積

標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制主要從定性和定量兩方面著手，定量包括了指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率、湯劑出膏率、pH等參數(shù)；定性則為控制整體成分的指紋圖譜。指標(biāo)成分是基于藥典指標(biāo)，具有法定效力，通過計(jì)算指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率，可明確有效成分傳遞規(guī)律；出膏率是標(biāo)準(zhǔn)湯劑整體成分的反映。通過出膏率既可以反映已知成分，又可以反映未知成分[15]。此外，出膏率還可為后續(xù)的配方顆粒成品量提供參考數(shù)據(jù)。pH 可以作為輔助參考。指紋圖譜不僅能反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主要化學(xué)成分，還能有效反應(yīng)配方顆粒等失去中藥外表特征的中藥制劑的主要化學(xué)成分，這一方法的出現(xiàn)為紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

紫蘇葉含有揮發(fā)油，為了更好的保留這類成分，測定這類藥材時(shí)，需要將其單獨(dú)提取出來，參考含揮發(fā)油飲片-桂枝，姜黃，肉桂標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備中揮發(fā)油的提取工藝，即采用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油，頭煎2 h，二煎0.5 h，而后將提取到的紫蘇葉揮發(fā)油兌入濃縮的湯劑中。藥典中明確規(guī)定紫蘇葉飲片揮發(fā)油含量最少為0.20%（mL·g-1），本研究以5個(gè)產(chǎn)地不同規(guī)格等級的17批紫蘇葉飲片為研究對象，測得紫蘇葉飲片的揮發(fā)油含量為0.30-1.20%（mL·g-1），紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的揮發(fā)油含量為0.30-1.00%（mL·g-1），揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率為87.20±11.84%，該數(shù)值說明紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率較高。

表6 紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑中3個(gè)共有峰的含量結(jié)果

本文以17 批不同產(chǎn)地的紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑為研究對象，建立紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評價(jià)方法，經(jīng)測定，17 批紫蘇葉飲片揮發(fā)油含量均符合藥典規(guī)定的要求，但是不同批次間揮發(fā)油含量還是存在很大差異。所得紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率范圍為14.50%-24.80%，揮發(fā)油的轉(zhuǎn)移率范圍為62.50%-100.00%，pH 值范圍為4.70-5.25。經(jīng)“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”軟件進(jìn)行色譜峰匹配，結(jié)果表明17 批紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度相對較高，均大于0.8，確定共有峰7 個(gè)，指認(rèn)3 個(gè)?？Х人岬暮糠秶鸀?3.71-209.85 μg·mL-1，野 黃 芩 苷 的 含 量 范 圍 為144.62-1985.16 μg·mL-1，迷 迭 香 酸 的 含 量 范 圍 為121.08-1465.46 μg·mL-1，建立的紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評價(jià)方法可為紫蘇葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考數(shù)據(jù)。