秦中朋，詹向紅

（河南中醫(yī)藥大學(xué)認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450046）

“夫百病之始生也，皆生于……，陰陽(yáng)喜怒，……大驚卒恐?！薄秲?nèi)經(jīng)》中如此論述不良情緒對(duì)于疾病的影響，而近年來(lái)隨著人口老齡化程度的持續(xù)加劇、社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的日趨激烈和生物-心理-社會(huì)醫(yī)學(xué)模式的認(rèn)可實(shí)踐，由長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累引發(fā)的疾病愈發(fā)多見(jiàn)且已被證實(shí)是腦老化相關(guān)疾病如輕度認(rèn)知功能障礙（Mild cognitive impairment，MCI）、癡呆等的危險(xiǎn)因素[1，2]。癡呆病死率高，危害嚴(yán)重，一旦罹患對(duì)大腦造成的神經(jīng)元損傷不可逆轉(zhuǎn)[3]，給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)[4，5]，并且當(dāng)前藥物研究的局面不甚樂(lè)觀(guān)[6]。而緩衰益智是中醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢(shì)領(lǐng)域，一般認(rèn)為，癡呆等腦老化疾病主要病位在腦，與五臟六腑功能失調(diào)[7]和痰濁血瘀阻塞腦竅[8]進(jìn)而引起的精氣血津液運(yùn)行輸布有礙、不能上充于腦關(guān)系密切，然而精氣血津液的運(yùn)行輸布和五臟功能的正常發(fā)揮均有賴(lài)于全身氣機(jī)的通調(diào)暢達(dá)，肝主疏泄、調(diào)暢全身氣機(jī)是中醫(yī)學(xué)的特色命題，因此肝失疏泄對(duì)腦老化相關(guān)疾病的影響亦不容忽視。但是肝失疏泄如何影響腦老化相關(guān)進(jìn)程，其現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)制又是怎樣呢？當(dāng)前文獻(xiàn)卻少有報(bào)道，因此課題組進(jìn)行了如下的思考和探索。

1 確定科學(xué)假說(shuō)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累人群易處于慢性情緒應(yīng)激狀態(tài)[9]，經(jīng)久不調(diào)容易造成下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamic pituitary adrenal，HPA）軸[10]的過(guò)度激活，繼而引起糖皮質(zhì)激素水平的持續(xù)升高，而作為學(xué)習(xí)記憶關(guān)鍵部位的海馬，富含糖皮質(zhì)激素受體，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)更加敏感，極易受到損害[11]，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降繼發(fā)癡呆等。中醫(yī)學(xué)中亦有“情志失調(diào)影響腦老化進(jìn)程”相關(guān)記載：如《景岳全書(shū)》曰：“癡呆癥……，或以郁結(jié)，或以不遂，或以思慮，或以驚恐而漸癡呆”；《辯證錄·呆病門(mén)》論述：“大約起始也，起于肝氣之郁”，明確指出肝氣郁結(jié)肝失疏泄可能是腦老化加速并導(dǎo)致癡呆的始動(dòng)因素?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者對(duì)此亦有認(rèn)識(shí)：陳立典團(tuán)隊(duì)[12]通過(guò)調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)肝病位證素占到了福州市老年MCI 人群中醫(yī)證素的第一位；龔華強(qiáng)等[13]通過(guò)對(duì)認(rèn)知障礙門(mén)診中的MCI患者進(jìn)行中醫(yī)證候調(diào)查，發(fā)現(xiàn)肝氣郁結(jié)證候占據(jù)所有MCI 患者中醫(yī)證候的首位，占比達(dá)到38.50%；于梅等[14]通過(guò)對(duì)157例老年期癡呆病人進(jìn)行中醫(yī)辨證分型調(diào)查發(fā)現(xiàn)：具有肝氣郁證候的癡呆病例占比達(dá)39.49%；田金洲團(tuán)隊(duì)[15]等通過(guò)文獻(xiàn)研究MCI 證候要素分布，發(fā)現(xiàn)肝病在中醫(yī)病位證候中占到14.17%。一般認(rèn)為，情志是中醫(yī)學(xué)對(duì)于情緒的特有稱(chēng)謂，其不僅是個(gè)體接受外界刺激后產(chǎn)生的主觀(guān)反映，同時(shí)也是五臟六腑的功能活動(dòng)以及精氣血津液充盛與否的內(nèi)在表現(xiàn)。若長(zhǎng)期情志失常，經(jīng)久不調(diào)，勢(shì)必導(dǎo)致肝失疏泄，氣機(jī)失常，氣血逆亂，精氣血津液運(yùn)行輸布有礙，或氣血虧虛，腦失濡養(yǎng)；或痰瘀互結(jié)，清竅阻塞，化毒為害；或二者并見(jiàn)，虛實(shí)夾雜繼而傷及臟腑，擾亂神志，導(dǎo)致神機(jī)失靈，引發(fā)認(rèn)知功能障礙而腦老化加速。

因此綜合以上研究分析，結(jié)合對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、中醫(yī)學(xué)研究現(xiàn)狀的總結(jié)和討論，課題組提出了“長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累肝失疏泄加速腦老化進(jìn)程”的科學(xué)假說(shuō)，認(rèn)為曠日持久的情志失常，經(jīng)久不調(diào)會(huì)導(dǎo)致肝失疏泄，影響全身氣機(jī)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，進(jìn)而影響五臟精華之血和六腑清陽(yáng)之氣的輸布匯聚，最終導(dǎo)致腦之神機(jī)失用，加速腦老化等相關(guān)進(jìn)程。課題組依托國(guó)家自然科學(xué)基金和國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研發(fā)計(jì)劃的系列資助，進(jìn)行了該假說(shuō)的一系列探索和實(shí)驗(yàn)，在一定程度上驗(yàn)證了“長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累肝失疏泄加速腦老化”的部分機(jī)制，并探索創(chuàng)新了一些比較成熟的研究技術(shù)和方法。

2 創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方法

近年來(lái)，課題組在“肝失疏泄加速腦老化”這一科學(xué)假說(shuō)指導(dǎo)下，探索并創(chuàng)新間接電擊激怒法的單一長(zhǎng)期憤怒誘發(fā)模型和復(fù)合長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激動(dòng)物大鼠模型、首創(chuàng)正常人群憤怒情志誘發(fā)試驗(yàn)材料的影片片段、探索并完善被試者的一般情況記錄表及認(rèn)知功能篩查方案、制作并完善多個(gè)事件相關(guān)電位技術(shù)（Eventrelated potentials，ERPs）研究范式等。

2.1 創(chuàng)新“單一”長(zhǎng)期憤怒情緒、復(fù)合負(fù)性情緒應(yīng)激大鼠動(dòng)物模型和正常人群憤怒情緒誘發(fā)材料

一般認(rèn)為，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是從宏觀(guān)到微觀(guān)層次深入認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的重要媒介。因此在探索長(zhǎng)期憤怒情志影響腦老化進(jìn)程的研究中，課題組首先從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，基于常見(jiàn)憤怒情緒造模方法如直接電擊法所誘發(fā)的情緒較為多樣復(fù)雜、兼有一定的恐懼情緒特征和憤怒情緒擊中率不高；間接夾尾刺激法對(duì)攻擊鼠易造成尾部皮膚損傷且進(jìn)行夾尾操作時(shí)攻擊鼠往往出現(xiàn)不攻擊應(yīng)激鼠反而回頭撕咬止血鉗的情況；居住入侵法等所誘發(fā)的憤怒情緒程度輕和時(shí)間短不能滿(mǎn)足長(zhǎng)期憤怒情緒的要求（表1）。因此受直接電擊法和間接夾尾刺激法啟發(fā)[16，17]，課題組改良了間接電擊激怒法的長(zhǎng)期憤怒情緒大鼠動(dòng)物模型[18，19]：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用電極末端電擊刺激攻擊鼠胸腹部，攻擊鼠受電擊刺激后被激惹，不久即對(duì)其前方實(shí)驗(yàn)組大鼠發(fā)起攻擊，雙方互相對(duì)峙、打斗、撕咬，繼而產(chǎn)生憤怒心理。使用間接電擊法每天刺激攻擊鼠15 min，刺激頻率為1-2 次/min，連續(xù)干預(yù)4 周后結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組大鼠鼠毛豎立、怒目而視、佯攻尖叫、威嚇對(duì)峙，甚至撕咬、攀壓、打斗等，表情行為較好符合憤怒應(yīng)激狀態(tài)特征[20]。該造模方法誘發(fā)憤怒情緒較為單純、應(yīng)激持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、軀體應(yīng)激刺激少，較為適合“單一”長(zhǎng)期憤怒情緒大鼠動(dòng)物模型的制備。此外需要說(shuō)明的是：以上造模方法所誘發(fā)的憤怒情緒仍然是混合情緒，并非嚴(yán)格意義的單一長(zhǎng)期憤怒情緒，但相比較于當(dāng)前文獻(xiàn)其他憤怒情志造模方法，該法誘發(fā)憤怒情緒的擊中率和持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，更加接近于單一長(zhǎng)期憤怒情緒的研究目的。

表1 常見(jiàn)憤怒情志應(yīng)激大鼠動(dòng)物模型的特點(diǎn)

表2 常見(jiàn)長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激（抑郁）大鼠動(dòng)物模型的特點(diǎn)

在間接電擊法制備單一憤怒情緒大鼠模型基礎(chǔ)上，課題組繼而改良并優(yōu)化了多情交織作用下的復(fù)合長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激大鼠動(dòng)物模型[21]。鑒于常見(jiàn)慢性負(fù)性情緒應(yīng)激造模方法如慢性束縛法造模時(shí)間長(zhǎng)且可能對(duì)動(dòng)物本身產(chǎn)生軀體應(yīng)激[22，23]、空瓶應(yīng)激法所誘發(fā)的情緒重復(fù)性低、居住入侵（社交失?。┓ㄔ炷３晒β实蚚23]等缺點(diǎn)，而慢性輕度不可預(yù)知性心理應(yīng)激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）造模方法可通過(guò)給予大鼠溫和、隨機(jī)和長(zhǎng)期不同的應(yīng)激因子而較好誘發(fā)和模擬人類(lèi)的慢性長(zhǎng)期抑郁狀態(tài)[24]（表2）。因此課題組選用改進(jìn)的CUMS誘導(dǎo)方法[25-27]，并創(chuàng)新將其中易產(chǎn)生軀體應(yīng)激的直接電擊和禁食禁水等刺激分別替代為慢性不可預(yù)知性心理應(yīng)激因子間接電擊和懲罰性飲水[28]、將每種心理應(yīng)激刺激時(shí)間稍微延長(zhǎng)以更好誘發(fā)抑郁情緒并最大程度減少可能引起的焦慮因子[29]，最終將CUMS模型綜合改進(jìn)為下述8種不同的心理應(yīng)激因子，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天隨機(jī)序貫對(duì)應(yīng)激組大鼠施以其中的一種[30，31]：①束縛：使用束縛筒束縛大鼠6 h·天-1；②溫水游泳：15 min·天-1；③間接電擊刺激攻擊鼠：15 min·天-1，頻率為1-2 次·min-1；④強(qiáng)光刺激：5 h·天-1，照明頻率為300 閃光·min-1；⑤搖晃：設(shè)置振蕩器30 min，頻率160 次·min-1；⑥潮濕墊料：12 h；⑦噪聲：3 h·天-1，強(qiáng)度為 90 dB；⑧懲罰性飲水：10 min·天-1等，持續(xù)造模4 周后結(jié)果發(fā)現(xiàn)：應(yīng)激組大鼠目光無(wú)神，毛發(fā)零亂，攝水?dāng)z食量明顯減少，頭部蜷縮在身體中，夜間不時(shí)發(fā)出細(xì)聲尖叫，以上表情行為較好符合長(zhǎng)期負(fù)性情緒抑郁狀態(tài)。此方法充分借鑒了上述間接電擊法的造模優(yōu)勢(shì)，合理控制了軀體刺激成分，并將心理應(yīng)激因子隨機(jī)序貫干預(yù)且使單一應(yīng)激因子的作用時(shí)間稍微延長(zhǎng)，較為適用于制備長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激抑郁大鼠模型。

鑒于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究成果無(wú)法直接推及正常人群，課題組繼而創(chuàng)新制備了正常人群憤怒情緒誘發(fā)材料[32]：基于使用圖片、音樂(lè)或氣味等誘發(fā)的靶情緒強(qiáng)度和生態(tài)效度不理想，而影片采用視聽(tīng)雙通道高強(qiáng)度誘發(fā)靶情緒且具有較高的生態(tài)學(xué)效度。因此課題組成員充分參考國(guó)內(nèi)外情緒研究者使用的影片材料，經(jīng)過(guò)大量走訪(fǎng)、調(diào)查并聽(tīng)取多方權(quán)威專(zhuān)家、電影制片人和導(dǎo)演推薦，初步剪輯合成4部憤怒情緒誘發(fā)影片片段，經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后隨機(jī)選取某高校161名學(xué)生自愿者隨機(jī)觀(guān)看以上影片，以情緒誘發(fā)強(qiáng)度、擊中率、差異顯著性等作為靶情緒誘發(fā)強(qiáng)度評(píng)定指標(biāo)，并經(jīng)二次優(yōu)化改良后刪掉以上合成影片中令人厭惡的鏡頭和其它血淋淋的場(chǎng)面，最終再次選取75名自愿者觀(guān)看后發(fā)現(xiàn)：制作合成的《罪惡和審判》影片片段誘發(fā)憤怒情緒最佳[33]。

2.2 探索并制作認(rèn)知功能的流行病學(xué)調(diào)查軟件及一般情況記錄表等篩查方案

當(dāng)前對(duì)于腦老化相關(guān)疾病如MCI、癡呆等重要的診斷方法仍是量表檢測(cè)，課題組通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)和開(kāi)展系列預(yù)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合使用蒙特利爾評(píng)估量表（Montreal Cognitive Assessment, MoCA）和簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表（Mini-mental state examination, MMSE）初篩MCI患者，并用日常生活活動(dòng)能力量表、全面衰退量表以及自編一般情況調(diào)查表[34]（包括性別、年齡、職業(yè)、婚姻狀況、受教育年限、家庭經(jīng)濟(jì)情況、家庭居住地、是否患有或曾患有影響認(rèn)知功能的疾病、是否服用藥物以及聽(tīng)視覺(jué)障礙等信息）以再次確診MCI 患者的流行病學(xué)調(diào)查方案最佳[35]，并已將以上成果申報(bào)制作流行病學(xué)篩查軟件且經(jīng)過(guò)多個(gè)國(guó)家自然科學(xué)基金試驗(yàn)驗(yàn)證以上方案有效可行。

2.3 制作、改良并完善工作記憶、前瞻記憶及執(zhí)行功能事件相關(guān)電位實(shí)驗(yàn)范式

近年來(lái)，ERPs以其高時(shí)間分辨率、低成本、客觀(guān)性強(qiáng)、對(duì)人體無(wú)創(chuàng)傷且便于反映認(rèn)知的動(dòng)態(tài)時(shí)間特征等優(yōu)勢(shì)被譽(yù)為是觀(guān)察腦高級(jí)功能的窗口，因此課題組將ERPs探索引入研究“長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累肝失疏泄加速腦老化”的相關(guān)神經(jīng)電生理機(jī)制中。鑒于腦老化等認(rèn)知障礙性疾病多以記憶力下降為主，其中工作記憶[36]、前瞻記憶[37]及其相關(guān)的執(zhí)行功能[38]是其重要的受損成分，課題組先后完善并改良了研究以上成分的ERPs范式：分別采用不同任務(wù)負(fù)荷的中文版數(shù)字廣度N-back 實(shí)驗(yàn)范式以評(píng)估肝失疏泄型MCI 患者言語(yǔ)和空間工作記憶受損情況[39]；采用標(biāo)準(zhǔn)版紅黃綠3 種顏色和人物、動(dòng)物、植物和日用品4 類(lèi)常見(jiàn)的400 個(gè)漢語(yǔ)詞語(yǔ)組成的“色詞”前瞻記憶雙任務(wù)研究范式評(píng)估被試者前瞻記憶水平：進(jìn)行中任務(wù)為每一次刺激呈現(xiàn)時(shí)，請(qǐng)被試者在規(guī)定時(shí)間內(nèi)判斷屏幕中間出現(xiàn)的2個(gè)詞語(yǔ)是否屬于同類(lèi)，如果相同，則按【J】鍵，如果不同，則按【F】鍵。前瞻記憶任務(wù)為：若屏幕中間顯示的2個(gè)詞語(yǔ)為隨機(jī)數(shù)確定的紅黃綠3 種特定顏色中的1 種，被試者則不用進(jìn)行詞類(lèi)判斷，只需按下空格鍵。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)研究結(jié)果顯示以上范式可較好誘發(fā)前瞻記憶P200、N300、PP 等特異性ERPs 成分；在此基礎(chǔ)上，我們又創(chuàng)新完善了執(zhí)行功能3個(gè)相關(guān)范式評(píng)估被試者執(zhí)行功能受損情況：分別是紅黃綠3 種顏色和紅黃綠3 個(gè)字組成的色詞stroop 抑制控制試驗(yàn)范式、N-back 數(shù)字廣度記憶刷新試驗(yàn)范式以及1-9（不包括5）共8 個(gè)數(shù)字和紅綠2種顏色組成并根據(jù)不同顏色分別判斷數(shù)字大小和奇偶的靈活轉(zhuǎn)換試驗(yàn)范式，并經(jīng)相關(guān)預(yù)試驗(yàn)研究證實(shí)以上范式有效可行。

3 逐層開(kāi)展探索

課題組從2006 年開(kāi)始，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，先后在河南省鄭州市及其周邊城市、山東省濟(jì)南市及其周邊城市等多地進(jìn)行了“肝失疏泄加速腦老化進(jìn)程”3個(gè)層次的深入研究，逐層探索了單一長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累（憤怒情緒）對(duì)認(rèn)知老化進(jìn)程的影響、多情交織作用下的長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累（復(fù)合情緒）對(duì)認(rèn)知老化進(jìn)程的影響、疏肝解郁方藥對(duì)認(rèn)知老化進(jìn)程的影響及機(jī)制研究，其具體步驟和成果簡(jiǎn)述如下：

3.1 單一負(fù)性情緒積累（憤怒情志）對(duì)認(rèn)知老化進(jìn)程的影響

中醫(yī)學(xué)對(duì)“怒傷肝”理論頗有認(rèn)識(shí)，如《內(nèi)經(jīng)》有云：“肝在志為怒，怒傷肝，悲勝怒”，另有“大怒則形氣絕，而血菀于上，使人薄厥”等論述。怒作為負(fù)性情緒的重要組成部分，當(dāng)前社會(huì)環(huán)境下其對(duì)個(gè)體身心健康和認(rèn)知老化進(jìn)程如癡呆等影響愈發(fā)突出[40]。因此，課題組首先從單一長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累憤怒情緒入手，以動(dòng)物、阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease, AD）患者和正常在校大學(xué)生為試驗(yàn)對(duì)象，分別進(jìn)行了憤怒情緒與認(rèn)知功能減退的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究、憤怒情緒積累與認(rèn)知功能減退的回溯性病例對(duì)照研究、憤怒情緒對(duì)正常人群的工作記憶研究和個(gè)體差異ERPs 研究。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，課題組先后通過(guò)大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，大鼠的病理組織大腦皮層、海馬及神經(jīng)元形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)，血漿氧化指標(biāo)檢測(cè)，神經(jīng)內(nèi)分泌HPA 軸功能檢測(cè)等，證實(shí)長(zhǎng)期憤怒情緒可顯著降低大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，加重大鼠大腦海馬神經(jīng)元退行性病變，HPA 軸過(guò)度激活，提示長(zhǎng)期憤怒情志可明顯加速大鼠腦老化進(jìn)程[18]；那么憤怒情緒對(duì)AD 患者的影響是怎樣的呢？課題組在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，對(duì)部分AD 患者進(jìn)行了憤怒情緒積累與認(rèn)知功能減退的回溯性病例對(duì)照研究[41]：發(fā)現(xiàn)其OR值（95%CI）為51.857（14.009,191.954），提示長(zhǎng)期憤怒情緒積累是AD 發(fā)病的危險(xiǎn)因素；那么憤怒情緒對(duì)正常人群的影響是否也是如此？為使動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床患者研究成果推及正常人群，課題組使用工作記憶行為學(xué)測(cè)試軟件對(duì)高低憤怒特質(zhì)組正常大學(xué)生施以課題組制作的憤怒情志誘發(fā)影片[32]后發(fā)現(xiàn)：高憤怒被試者工作記憶容量下降，高特質(zhì)怒喚醒狀態(tài)可改變神經(jīng)內(nèi)分泌功能；并在此基礎(chǔ)上，課題組進(jìn)一步使用go/nogo 試驗(yàn)范式對(duì)高低特質(zhì)被試者進(jìn)行ERPs 研究抑制控制能力后發(fā)現(xiàn)：與低特質(zhì)怒個(gè)體相比，高特質(zhì)怒個(gè)體nogo 刺激時(shí)平均腦電P300 波幅較小，提示高特質(zhì)怒者抑制控制能力較低[42]。以上試驗(yàn)分別證實(shí)長(zhǎng)期憤怒情志可加速大鼠和AD 患者認(rèn)知老化進(jìn)程，影響正常人群認(rèn)知功能。

然而，當(dāng)前生物-心理-社會(huì)醫(yī)學(xué)模式下負(fù)性情緒應(yīng)激往往呈現(xiàn)多情交織共同致病，如喬明琦課題組[43]通過(guò)對(duì)553 例情志病患者流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：兩種或兩種以上負(fù)性情緒多情交織共同致病者高達(dá)88.97%，周鶯等[44]、張慧等[45]分別通過(guò)研究古代和清代情志病證醫(yī)案，同樣發(fā)現(xiàn)多種情質(zhì)因素共同致病最為常見(jiàn)。那么多情交織作用下的長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累對(duì)于認(rèn)知老化進(jìn)程的影響又是怎樣呢？

3.2 長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累對(duì)認(rèn)知老化進(jìn)程的影響

以長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累為自變量，課題組分別進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究、正常人群的ERPs 研究和MCI 與正常人的病例對(duì)照研究。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，課題組采用上述優(yōu)化和改良的長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激大鼠模型，分別進(jìn)行了曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、大腦皮層形態(tài)學(xué)、血漿氧化指標(biāo)、HPA軸指標(biāo)、谷氨酸和Ca2＋濃度、海馬神經(jīng)元NMDAR、CaM、CREB 檢測(cè)以及甲基化程度等檢測(cè)，結(jié)果顯示：相比較對(duì)照組，長(zhǎng)期負(fù)性情緒應(yīng)激組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少、排列松散、胞核染色變淺且伴有膠質(zhì)細(xì)胞增生，HPA軸ACTH、CORT等激素含量明顯升高，大鼠海馬NMDAR 含量顯著增加[21]，NR2B 和 BDNF 基因啟動(dòng)子區(qū) CpG 甲基化程度顯著增高[31]，提示長(zhǎng)期復(fù)合負(fù)性情緒積累可加速大鼠認(rèn)知老化進(jìn)程；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，課題組篩選長(zhǎng)期負(fù)性積累人群自愿者并對(duì)其進(jìn)行了流體智力檢測(cè)，衰老生物學(xué)指標(biāo)8-OHdG、SOD、LPO檢測(cè)，端粒長(zhǎng)度、活性以及ERPs試驗(yàn)，結(jié)果顯示長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累人群總體智力水平和反映速度有所下降[46]、衰老生物學(xué)以上3 個(gè)指標(biāo)均高于對(duì)照組，端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性均低于對(duì)照組[47]，腦電試驗(yàn)N1 波幅、PP 潛伏期延長(zhǎng)，認(rèn)知加工速度下降[48]，提示長(zhǎng)期負(fù)性積累可加速正常人群腦老化進(jìn)程；鑒于A(yíng)D 病程的不可逆和目前不甚樂(lè)觀(guān)的藥物研究局面，課題組招募AD 前期的肝氣郁結(jié)型MCI 患者進(jìn)行了病例對(duì)照研究，其OR 值（95%CI）為5.364（1.774, 16.225），提示長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累是MCI 的危險(xiǎn)因素。以上研究結(jié)果證實(shí)長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累可加速動(dòng)物、MCI 患者認(rèn)知老化進(jìn)程，影響正常人群認(rèn)知功能。鑒于中醫(yī)學(xué)在未病先防、既病防變的緩衰益智方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，那么使用疏肝解郁的方法對(duì)長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累MCI 患者進(jìn)行用藥干預(yù)，能否改善其認(rèn)知功能，其神經(jīng)機(jī)制又是什么呢？

3.3 疏肝解郁方藥對(duì)認(rèn)知老化進(jìn)程的影響及機(jī)制研究

肝主疏泄的調(diào)控部位在腦，而高空間分辨率的功能磁共振技術(shù)（Functional magnetic resonance imaging，fMRI）可較為立體而準(zhǔn)確地定位腦功能和結(jié)構(gòu)的損傷部位，因此我們將fMRI技術(shù)引入到研究疏肝法對(duì)認(rèn)知老化進(jìn)程的影響及機(jī)制中。

經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2015HL-059），課題組選取長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累肝失疏泄MCI 患者的一種常見(jiàn)中醫(yī)證型—肝氣郁結(jié)證進(jìn)行研究，使用上述認(rèn)知功能篩查方案和肝氣郁結(jié)證癥狀程度計(jì)分表[49]（需要說(shuō)明的是，課題組在使用肝郁量表評(píng)判被試者肝郁程度時(shí)，會(huì)向被試者強(qiáng)調(diào)說(shuō)明該量表選項(xiàng)中的每個(gè)癥狀發(fā)生時(shí)間均要持續(xù)3個(gè)月以上，以盡可能保證被試者的肝郁癥狀是長(zhǎng)期情志不暢而非一時(shí)之郁），綜合篩選46-65周歲的肝氣郁結(jié)型MCI 用藥組、肝氣郁結(jié)型MCI 未用藥組和正常對(duì)照組3組自愿者，使用疏肝解郁代表方藥逍遙丸（河南省宛西制藥股份有限公司，批號(hào)：140409）對(duì)肝氣郁結(jié)型MCI 用藥組自愿者進(jìn)行連續(xù)3 個(gè)月用藥干預(yù)，并分別進(jìn)行用藥前后3 個(gè)月的兩次工作記憶的ERPs 檢測(cè)、fMRI 的磁共振波譜、功能連接和局部一致性研究，以及衰老生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)和韋氏成人記憶量表檢測(cè)等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝氣郁結(jié)型用藥組MCI患者干預(yù)后MoCA 量表總分和所有認(rèn)知域得分均有所增加[50]，磁共振波譜顯示用藥后右后扣帶回膽堿與肌酸的比值降低[51]，衰老生物學(xué)指標(biāo)8-OHdG 含量降低，端粒酶活性升高[52]，Oddball任務(wù)中P300波幅已與正常無(wú)顯著差異，N-back任務(wù)下P300潛伏期延長(zhǎng)，提示肝郁型MCI患者用藥干預(yù)3 個(gè)月后可逐漸恢復(fù)記憶模板；N400 潛伏期縮短、波幅降低，提示疏肝法可顯著改善MCI 患者認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與降低肝郁MCI 患者的氧化應(yīng)激水平、降低海馬環(huán)路中后扣帶回區(qū)域膽堿化合物水平以及改善工作記憶的編碼、儲(chǔ)存能力等有關(guān)。

4 總結(jié)和展望

綜上所述，課題組圍繞“長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累肝失疏泄加速腦老化進(jìn)程”的科學(xué)假說(shuō)，依次從單一長(zhǎng)期負(fù)性情緒（憤怒特質(zhì)）研究拓展到多情交織作用的長(zhǎng)期復(fù)合負(fù)性情緒積累，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究拓展到正常人群再到AD 和MCI 患者，從未用藥研究拓展到疏肝解郁方藥干預(yù)肝氣郁結(jié)型MCI 患者，并充分結(jié)合高時(shí)間分辨率的ERPs和高空間分辨率的fMRI等現(xiàn)代神經(jīng)心理學(xué)技術(shù)，有效證實(shí)了長(zhǎng)期負(fù)性情緒積累肝失疏泄可加速腦老化進(jìn)程；并在一定程度上提示使用疏肝法可在改善肝郁型MCI 患者肝郁癥狀的同時(shí)，也可有效改善和提高其總體認(rèn)知功能。

需要說(shuō)明的是，新近有研究證實(shí)前瞻記憶[37]和執(zhí)行功能[38]損傷也是認(rèn)知功能衰退的早期敏感指標(biāo)，并且兩成分損害呈現(xiàn)正相關(guān)[53]。此外，一般認(rèn)為眼睛（目）是大腦思維活動(dòng)和情緒變化的外在反映，同時(shí)也是大腦獲得外界信息的主要渠道，即察目可通于神，“肝開(kāi)竅于目”、“目系通于腦”，且當(dāng)前多項(xiàng)研究報(bào)道眼動(dòng)技術(shù)可提供敏感的、非侵入性的認(rèn)知（變化或惡化）的標(biāo)記，是早期診斷MCI 及AD 的敏感工具[54]。因此，課題組下一步將從前瞻記憶和執(zhí)行功能角度入手，聯(lián)合使用神經(jīng)心理學(xué)ERPs、fMRI 和眼動(dòng)技術(shù)等，對(duì)疏肝法改善肝郁型MCI 患者的神經(jīng)心理學(xué)機(jī)制進(jìn)行多維度深入研究，以期為MCI 的中醫(yī)臨床干預(yù)提供新思路，為中醫(yī)腦老化學(xué)說(shuō)增添新內(nèi)涵。