謝國(guó)艷,蔡 楓,梁 斌,裴凌燕,馮 琪

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200071)

銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa，PAE)是醫(yī)院感染的重要條件致病菌，近年來隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類PAE逐年增多，感染患者的死亡率也在逐年上升[1]，對(duì)臨床感染治療構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamases, MBLs)是PAE對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要原因，其基因型以IMP 和VIM為主[2]，及時(shí)檢測(cè)產(chǎn) MBLs的PAE是非常必要的。目前MBLs的表型篩選方法主要是美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standaards Institute,CLSI) 推薦的改良的碳青霉烯類失活法(modified carbapenem inactivation method，mCIM)[3]，此法可適用于耐碳青霉烯類的腸桿菌科及PAE菌株檢測(cè)。而PAE改良Hodge試驗(yàn)(PAE-MHT)法是PASTERAN等[4]針對(duì)改良Hodge試驗(yàn)(MHT)法只適合檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌的碳青霉烯酶的局限性而進(jìn)行的改進(jìn)，從而使PAE-MHT法可以用于PAE的MBLs檢測(cè)。國(guó)內(nèi)有關(guān)mCIM法檢測(cè)腸桿菌科的報(bào)道頗多，但對(duì)PAE的研究甚少，本研究以PAE為研究對(duì)象，對(duì)mCIM法和PAE-MHT法篩選PAE產(chǎn)MBLs的能力進(jìn)行評(píng)估，為流行病學(xué)研究及感染控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 選取2015年8月～2019年5月從上海市中醫(yī)醫(yī)院和上海市新華醫(yī)院崇明分院的臨床標(biāo)本中分離的176株碳青霉烯類耐藥的PAE株(112株耐IMP，36株耐MEM和28株同時(shí)耐藥)，均為非重復(fù)菌株。所有菌株均經(jīng)VITEK2- compact全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，菌株以甘油肉湯-20℃保存?zhèn)溆?。肺炎克雷伯菌ATCC700603、IPM-1型及VIM-2型PAE購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。大腸埃希菌ATCC25922購(gòu)自上海市臨檢中心。

1.2 試劑與儀器 VITEK2- compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀、MIC藥敏試驗(yàn)為 GN板(法國(guó)梅里埃公司)；10 μl 定量接種環(huán)(上海晶安公司)；亞胺培南(IMP)(10 μg)、美羅培南(MEM)(10 μg)藥敏紙片(OXOID公司)；MH培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)(上海伊華公司)；7000型熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó) Applied Biosystems公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；引物和探針及測(cè)序由上海生工公司完成。

1.3 方法

1.3.1 MBLs基因檢測(cè)：煮沸法提取細(xì)菌DNA，擴(kuò)增 IMP，VIM基因，所需的引物序列和PCR反應(yīng)條件及確認(rèn)方法見文獻(xiàn)[5]。

1.3.2 不同底物的mCIM法試驗(yàn)[3]：

1.3.2.1 方法：取10 μl接種環(huán)滿環(huán)的新鮮培養(yǎng)待測(cè)菌落于2ml TSB肉湯中，振蕩混勻，再將 1 0μg IMP，MEM紙片分別浸入菌懸液中，35℃大氣環(huán)境溫孵育4 h，孵育快結(jié)束時(shí)，配制0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c埃希菌 ATCC25922菌懸液，用無菌棉簽均勻涂布在 MH培養(yǎng)基上。用10μl接種環(huán)取出培養(yǎng)后的藥敏紙片并擠去多余菌液，貼至上述 MH培養(yǎng)基上，35℃孵育18～ 24 h，測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.3.2.2 結(jié)果判讀：碳青霉烯酶陽性：抑菌圈直徑為 6 ～15 mm 或直徑為 16～18 mm 但抑菌圈內(nèi)有散在菌落；碳青霉烯酶陰性：抑菌圈直徑≥19 mm 且圈內(nèi)無散在菌落；若抑菌圈直徑為16～18 mm 或直徑≥19 mm 但圈內(nèi)有散在菌落，無法判斷是否存在碳青霉烯酶。

1.3.3 PAE-MHT法[6]：將肺炎克雷伯菌ATCC700603調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海儆蒙睇}水1:10稀釋后均勻涂布MH平皿，室溫放置10mim后，貼MEM(10μg)紙片。挑取3～5個(gè)過夜生長(zhǎng)的待測(cè)菌，從紙片邊緣向外劃直線，35℃培養(yǎng)16～20h，觀察指示菌有無出現(xiàn)向MEM紙片增強(qiáng)生長(zhǎng)現(xiàn)象，若增強(qiáng)生長(zhǎng)，即為MBLs陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，不同藥物底物mCIM法檢測(cè)MBLs采用McNemar檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以 PCR檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算幾種方法的準(zhǔn)確度、敏感度及特異度，并將幾種方法與PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，K>0.75表示好的一致性，K<0.4表示一致性差。

2 結(jié)果

2.1 MBLs基因檢測(cè)結(jié)果 見表1。PCR擴(kuò)增176株耐碳青霉烯類PAE，共檢出21株MBLs基因陽性株，產(chǎn)酶陽性率為11.9%，其中耐IMP株的產(chǎn)酶陽性率為7.4%(13/176)，耐MEM株的產(chǎn)酶陽性率為1.1%(2/176)，同時(shí)耐藥的產(chǎn)酶株陽性率為3.4%(6/176)。

表1PCR檢測(cè)3種耐藥表型的基因分布情況(n=176)

耐 藥 表 型株 數(shù)IPM型VIM型耐 IMP11249耐MEM3602耐IMP+MEM2824

2.2 采用不同藥物底物mCIM法檢測(cè)MBLs結(jié)果 176株耐碳青霉烯類PAE，以IMP為底物篩選MBLs菌株，共檢出19株陽性株(IPM型6株，VIM型13株)，陽性率為10.8%；以MEM為底物篩選MBLs菌株，共檢出21株陽性株(IPM型7株，VIM型14株)，陽性率為11.9%。采用兩種底物mCIM法檢測(cè)MBLs的陽性檢測(cè)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.01，P>0.05)。以MEM為底物mCIM法檢測(cè)MBLs陽性株見圖1。

注：1為陰性對(duì)照，2為陽性菌，3為結(jié)果無法判定圖1 mCIM法

2.3 PAE-MHT法檢測(cè)MBLs結(jié)果 176株耐碳青霉烯類PAE測(cè)得18株菌株產(chǎn)MBLs，陽性率為10.2%，見圖2。

注：1，2為陰、陽性對(duì)照；3為陽性菌圖2 PAE-MHT法

2.4 方法學(xué)分析 見表2。以PCR法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較三種方法的準(zhǔn)確度、敏感度和特異度，同時(shí)三種方法分別與 PCR 結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，均K>0.75。

表2 不同方法檢測(cè)MBLs的性能評(píng)價(jià)

注：三者間在準(zhǔn)確度之間的兩兩比較，2分別為0.63，0.06和1.05，均P>0.05；三者間在敏感度之間的兩兩比較，2分別為0.16，0.01和0.23，均P>0.05；三者間在特異度之間的兩兩比較，χ2分別為2.00，0.20 和2.99，均P>0.05。

3 討論

PAE在不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌感染中僅次于不動(dòng)桿菌屬排第二位，對(duì)碳青霉烯類生素的耐藥情況越來越嚴(yán)峻[7]。最新文獻(xiàn)報(bào)道[8]，頭孢他啶-阿維巴坦、美羅培南/韋博巴坦等新藥可有效抑制A類絲氨酸碳青霉烯酶，但對(duì)B類MBLs無效，因此治療產(chǎn)MBLs的PAE菌株更為棘手。

CLSI 推薦mCIM法是以MEM為底物的檢測(cè)方法，閆玲等[3]發(fā)現(xiàn)以IMP為底物檢測(cè)腸桿菌科產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的效果更好，因此本研究也設(shè)計(jì)采用不同藥物作底物的mCIM法來檢測(cè)PAE產(chǎn)MBLs株，以便尋找出檢測(cè)PAE產(chǎn)MBLs最適合的底物。本研究以PCR法結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)兩種底物的mCIM法和PAE-MHT法篩選PAE產(chǎn)MBLs的能力進(jìn)行評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，不同底物的檢測(cè)方法在陽性率方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.01，P>0.05)，但對(duì)某些特殊菌株的結(jié)果判斷有所不同：有2株菌株在以MEM為底物的mCIM法中能明確的判斷為陽性(抑菌圈直徑<15mm)，而以IMP為底物的mCIM法的直徑為16～18 mm 無法判斷是否產(chǎn)MBLs，通過PCR法確定為MBLs陽性，推測(cè)其原因可能是菌株產(chǎn)MBLs量少，水解IMP的能力弱于MEM，因此以MEM為底物的mCIM法敏感度最好，更適合于PAE的MBLs檢測(cè)。

將三種方法分別與PCR法進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，MEM為底物的mCIM法的K值為0.856，IMP為底物的mCIM法的K值為0.780，PAE-MHT法的K值為0.751，說明三者與PCR法均具有好的一致性。同時(shí)研究結(jié)果顯示：三者在準(zhǔn)確度、敏感度和特異度之間兩兩相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。三種方法的準(zhǔn)確度、特異度都非常好，而在敏感度方面的比較，以MEM為底物的mCIM法敏感度最好，為100%，其次分別是IMP為底物的mCIM法90.5%，PAE-MHT法85.7%。

PCR法是目前檢測(cè)MBLs最為準(zhǔn)確、可靠的方法，但某些醫(yī)院在硬件設(shè)施方面達(dá)不到建造PCR實(shí)驗(yàn)室的要求，因此PCR檢測(cè)不能在臨床全面開展。PAE-MHT法通過改變指示菌，用肺炎克雷伯菌ATCC700603代替大腸埃希菌ATCC25922，觀察指示菌有無出現(xiàn)向MEM紙片增強(qiáng)生長(zhǎng)現(xiàn)象來判定結(jié)果，從而避免了MHT試驗(yàn)針對(duì)PAE出現(xiàn)無法判定結(jié)果的問題，該方法經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便、易于判讀，對(duì)指示菌的菌液濃度要求不高，適于在基層臨床微生物實(shí)驗(yàn)室推廣，但敏感度低于mCIM法。mCIM法檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌和PAE是流行病學(xué)調(diào)查或感染控制為目的，mCIM對(duì)各種各樣的碳青霉烯酶保持較高的敏感度和特異度[9]，操作簡(jiǎn)便，但在試驗(yàn)中會(huì)受到某些因素的影響，如待測(cè)菌的純度、接種量的變化、大腸埃希菌菌液濃度高低及抑菌圈直徑結(jié)果無法判斷等問題，故要求應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行試驗(yàn)，以求得更可靠的結(jié)果。

MBLs表型檢測(cè)對(duì)于流行病學(xué)研究及感染控制工作有很重要的作用，因此選擇一種方便、實(shí)用的適合本實(shí)驗(yàn)室的MBLs表型篩選方法是非常必要的。