曹 蕾，李小月 ，羅慶禮 ，王亞平

(1.安慶市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽安慶 246003；2.安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，合肥 230000)

近年來(lái)，耐碳青霉烯的腸桿菌(carbapenem-resistant Enterbacteriaceae，CRE)引起了廣泛關(guān)注，而產(chǎn)碳青霉烯酶是引發(fā)耐藥的主要機(jī)制[1]。有報(bào)道顯示，產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE(carbapenemase-producing carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CP-CRE)比非CP-CRE毒力、致病力更強(qiáng)[2]，并能通過(guò)耐藥質(zhì)粒引起播散。明確CP-CRE診斷，有利于感染的控制和播散。因而，一種高效、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確篩選碳青霉烯酶的方法尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)選取三種操作簡(jiǎn)便、無(wú)需特殊儀器的方法：改良Hodge試驗(yàn)(modified Hodge test, MHT)，碳青霉烯類失活法(carbapenem inactivation method，CIM)和改良碳青霉烯類失活法(modified carbapenem inactivation method，mCIM)，結(jié)合本地區(qū)腸桿菌細(xì)菌耐藥情況，以PCR作為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估三種方法的表型篩選能力。

1 材料和方法

1.1 研究方向 收集安慶地區(qū)2013年01月～2017年12月臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌，挑選120株CRE，即對(duì)亞胺培南的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)≥4，其中肺炎克雷伯菌73株，大腸埃希菌24株，陰溝腸桿菌9株，產(chǎn)氣腸桿菌5株，弗氏枸櫞酸桿菌5株和黏質(zhì)沙雷菌4株。50株碳青霉烯類敏感的腸桿菌科細(xì)菌中大腸埃希菌30株，肺炎克雷伯菌20株。

1.2 試劑與儀器 全自動(dòng)微生物分析儀VITEK 2 Compact及配套板卡，哥倫比亞血瓊脂、水解酪蛋白培養(yǎng)基(法國(guó)生物梅里埃公司)；藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司)；PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像儀和電泳儀(美國(guó)伯樂公司)； 2×Es Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)公司)；50×TAE，瓊脂糖和胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic soy broth,TSB)(上海生工生物公司)，引物由大連寶生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 碳青霉烯酶表型的檢測(cè)：分別參照文獻(xiàn)[3-5]進(jìn)行CIM，mCIM和MHT試驗(yàn)及結(jié)果判讀。

1.3.2 碳青霉烯酶基因檢測(cè)：采用加熱煮沸法提取菌株 DNA 作為 PCR模板。參照文獻(xiàn)[6]合成碳青霉烯酶基因 blaKPC ，blaNDM，blaVIM，blaIMP，blaGES，blaOXA-48和blaOXA-23引物。 PCR擴(kuò)增體系 20μl：上、下游引物( 10mmol / L) 各 1μl，2×Taq Master Mix 10μl，ddH2O 7μl，模板 1μl。PCR擴(kuò)增參數(shù): 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s，56 ℃30 s，72 ℃ 1 min，共 30 個(gè)循環(huán); 72 ℃7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 12 g / L 瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物由大連寶生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng) BLAST 比對(duì)分析以確定基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分別計(jì)算CIM，mCIM和MHT的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，并進(jìn)行一致性分析，分別計(jì)算CIM， mCIM，MHT和PCR結(jié)果的一致率和kappa值。kappa值在0.41～0.60之間，表示一致性強(qiáng)度中等，kappa值在0.61～0.80之間，一致性強(qiáng)度為高度；kappa值在0.81～1.00之間，一致性強(qiáng)度為完全一致。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 見表1。120株CRE中，93株攜帶一種或多種耐藥基因，27株未檢出耐藥基因。除blaGES基因外，其他基因型均有檢出。50株碳青霉烯類敏感的腸桿菌科細(xì)菌未發(fā)現(xiàn)基因型。

表1 PCR,CIM,mCIM 和MHT試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果分布(株)

2.2 CIM,mCIM 和MHT試驗(yàn)結(jié)果 120株CRE中，CIM試驗(yàn)陽(yáng)性87株，陰性33株；mCIM 試驗(yàn)陽(yáng)性94株，陰性26株；MHT試驗(yàn)陽(yáng)性72株，陰性48株。三種方法篩選碳青霉烯酶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.796，P<0.05)。50株碳青霉烯類敏感的腸桿菌科細(xì)菌三種方法均陰性。

2.3 三種方法性能評(píng)價(jià) 見表2。以PCR結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)三種方法檢測(cè)CRE的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，mCIM試驗(yàn)的敏感度、特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均高于另外兩種方法。與PCR結(jié)果相比較，CIM，MHT和mCIM的一致率分別為90%，95%和77.4%，Kappa值分別為0.898，0.949和0.771。mCIM和CIM試驗(yàn)與PCR高度一致。

表2CIM,mCIM和MHT試驗(yàn)檢測(cè)CP-CRE性能評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)指標(biāo)CIMmCIMMHT敏感度(%)95.696.895.8特異度(%)72.792.350陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(%)90.397.874.2陰性預(yù)測(cè)值(%)88.988.988.9一致率(%)909577.4Kappa值0.8980.9490.771

3 討論

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室快速準(zhǔn)確地檢測(cè)CP-CRE的能力，是有效控制和預(yù)防病原菌播散的重要因素，也是實(shí)驗(yàn)室管理的一個(gè)至關(guān)重要的組成部分[7]，腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶是導(dǎo)致耐藥的主要機(jī)制，該酶常處于可移動(dòng)的質(zhì)粒上，細(xì)菌通過(guò)轉(zhuǎn)移耐藥質(zhì)粒將耐藥性傳遞給其他菌株引起播散。因而，對(duì)碳青霉烯酶的快速檢測(cè)將有利于臨床及早采取隔離措施，避免耐藥菌的進(jìn)一步播散。實(shí)驗(yàn)室快速鑒定CP-CRE是控制其擴(kuò)散的重要一環(huán)，約有55%的實(shí)驗(yàn)室使用PCR的方法來(lái)進(jìn)行鑒定，但耐藥基因檢測(cè)也存在一些缺陷，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件、人員、技術(shù)要求較高，同時(shí)也會(huì)受檢測(cè)的基因數(shù)量，引物突變等因素的影響而出現(xiàn)假陰性[8]，本研究中就有三株細(xì)菌，CIM,mCIM 和MHT試驗(yàn)均陽(yáng)性，但未檢測(cè)到試驗(yàn)中擴(kuò)增的這6種基因型，原因可能是因?yàn)镃RE耐藥基因多樣，而研究中選擇擴(kuò)增的基因有限。也可能是操作失誤或是引物突變而出現(xiàn)的假陰性，具體原因仍需實(shí)驗(yàn)論證。雖然目前PCR檢測(cè)耐藥基因仍舊是金標(biāo)準(zhǔn)，是流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和感染防治的基礎(chǔ)，但是，基因檢測(cè)有其不能避免的缺點(diǎn)，因而，仍需要一種快速經(jīng)濟(jì)的表型檢測(cè)方法。表型檢測(cè)提供了一種成本效益高的篩選過(guò)程可快速區(qū)分CP-CRE和非CP-CRE，避免不必要的分子檢測(cè)，且不受已知基因突變或分子靶點(diǎn)數(shù)量的限制[9]，也無(wú)需特殊儀器，人員要求不高，有利于基層實(shí)驗(yàn)室中開展。

本研究發(fā)現(xiàn)，mCIM試驗(yàn)敏感度、特異度和一致率高于CIM試驗(yàn)，與其他國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道一致[10-11]。CIM試驗(yàn)是由VAN DER IWALUW等[3]在2015年提出的一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉、敏感度高的檢測(cè)方法，2017年CLSI改良該方法-mCIM正式納入標(biāo)準(zhǔn)，用于流行病學(xué)調(diào)查和感控研究。mCIM試驗(yàn)用TSB替代生理鹽水，并將孵育時(shí)間延長(zhǎng)至4 h，更有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)酶量更充足、水解更充分，同時(shí)，可以增強(qiáng)對(duì)水解活性較弱、表達(dá)水平較低的或需要二價(jià)陽(yáng)離子才能激活的金屬酶(B組耐藥基因)的檢測(cè)，使得敏感度更高[12-13]。TAMMA等報(bào)道[14]，CIM試驗(yàn)在blaKPC,blaNDM 和blaOXA-48基因型上敏感度不及mCIM，本研究中發(fā)現(xiàn)mCIM對(duì)blaKPC,blaNDM敏感度可達(dá)100%。且mCIM試驗(yàn)不受菌齡、藥敏紙片以及細(xì)菌是否產(chǎn)黏液影響，使其敏感度和特異度更好。但mCIM試驗(yàn)在結(jié)果判讀中存在一個(gè)不確定的范圍，即與待測(cè)細(xì)菌菌液共孵育的美羅培南紙片，若其抑菌圈直徑為16～18mm，則需要再次驗(yàn)證，易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤判。目前，mCIM試驗(yàn)僅被CLSI推薦用于CRE的檢測(cè)，但是耐碳青霉烯的其他細(xì)菌(如：銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌)日益增多，其在這些細(xì)菌表型檢測(cè)中的意義如何，仍需更多試驗(yàn)證實(shí)。

與mCIM試驗(yàn)相比，MHT步驟更為簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，并且對(duì)于A 組(如：blaKPC)和D組(如：blaOXA-23)碳青霉烯酶顯示較好的檢測(cè)能力，但是對(duì)于B組金屬酶(如blaNDM，blaVIM，blaIPM)的檢測(cè)存在缺陷，造成該實(shí)驗(yàn)總體的敏感度低于其他兩種方法，也低于相關(guān)報(bào)道[15]。另外，研究中發(fā)現(xiàn)有兩株未檢測(cè)到基因型，且另兩種方法均陰性的菌株，MHT試驗(yàn)陽(yáng)性，有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)菌產(chǎn)ESBLs或者存在高水平的AmpC酶，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性[16-17]。

相比較而言，mCIM試驗(yàn)檢測(cè)CP-CRE的性能均高于CIM和MHT，可作為合適的碳青霉烯酶表型篩選試驗(yàn)。