李杰萍，鄒建平，江絮萍，楊 琳，劉桐宇，謝 榕

(1．武警福建總隊(duì)醫(yī)院 a．檢驗(yàn)科；b．婦產(chǎn)科, 福州 350003；2．福建省腫瘤醫(yī)院婦科腫瘤外科，福州 350014)

多不飽和脂肪酸(poly unsaturated fatty acids, PUFAs)作為一類獨(dú)特的生物活性物質(zhì)對人體有重要的生理功能，主要包含omega-3 PUFAs和omega-6 PUFAs兩大類，它們都是合成類二十烷酸化合物的前體，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜功能、調(diào)控基因表達(dá)、維持細(xì)胞因子和脂蛋白平衡、抗癌、抗炎和抗心血管病等生理功能，是目前營養(yǎng)生化研究熱點(diǎn)之一[1]。隨著時間的推移和社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展變化，特別是近100～150年以來，人類的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化。人類食物中omega-3 PUFAs含量明顯減少，而omega-6 PUFAs含量明顯增多，造成人類攝入的omega-3 PUFAs與omega-6 PUFAs比值嚴(yán)重失調(diào)。高omega-6/omega-3 PUFAs比值的膳食引發(fā)一系列慢性疾病如腫瘤、心血管疾病、糖尿病和自身免疫性疾病等，增加攝入omega-3 PUFAs對于保持身體健康和預(yù)防多種慢性疾病有著極為重要的意義[2-5]。Omega-3 PUFAs除了通過結(jié)合其受體發(fā)揮生物學(xué)功能外，還通過其衍生物或代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用[2,6]。我們以前的研究表明，omega-3 PUFAs衍生物(5Z,8Z,11Z,14Z,16E)-18-羥基-5,8,11,14,16-二十碳五烯酸[(5Z,8Z,11Z,14Z,16E)- 18-Hydroxy-5,8,11,14,16icosapentaenoic acid，18-HEPE]能有效抑制黑色素瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移[7]。本研究我們探討18-HEPE對子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer, EC)細(xì)胞侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人EC細(xì)胞株HEC-1B和RL952細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)保藏委員會細(xì)胞庫。HEC-1B細(xì)胞用含有10 g/dl滅活小牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg /ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基；RL95-2細(xì)胞采用含10 g/dl滅活小牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、NaHCO3及胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置37 ℃、5 ml/dl CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器 Trizol試劑盒購自美國Ambion公司；熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Coming公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；18-HEPE購自美國Cayman公司；抗MMP-2抗體、抗MMP-9抗體和抗PTEN抗體購自美國Santa Cruz公司；GAPDH抗體購自北京中山公司。實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；低溫高速離心機(jī)購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 侵襲實(shí)驗(yàn)：腫瘤細(xì)胞的侵襲潛力通過體外Transwell小室實(shí)驗(yàn)來評估，實(shí)驗(yàn)按照說明書進(jìn)行。首先，用Matrigel覆蓋Transwell板上室，將含不同濃度的18-HEPE處理的細(xì)胞(5×105)于無血清培養(yǎng)基中加入上室，500 μl含 FBS的培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室取出，小心擦去上層細(xì)胞，晾干后，固定、染色，于顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.2 實(shí)時定量PCR分析:收集細(xì)胞后，加入Trizol試劑提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行實(shí)時定量PCR。IL-6上游引物：5’-TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC-3’，下游引物：5’-GTGTAATTAAGCCTCCGACTTG-3’；GAPDH上游引物：5’-CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC-3’，下游引物：5’-TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3’。 反應(yīng)條件為93 ℃變性2 min，然后按93 ℃ 30s，55 ℃ 1min，72 ℃ 30s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。樣本結(jié)果均用GAPDH標(biāo)化，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，采用2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)量。

1.3.3 Western blot分析 ： 樣品進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后用50 g/L脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，棄溶液，加入用50 g/L脫脂奶粉稀釋的一抗，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次后，加入用50 g/L脫脂奶粉稀釋的二抗(辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔/羊抗鼠IgG)，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次后，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

2 結(jié)果

2.1 18-HEPE明顯抑制EC細(xì)胞的侵襲 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。18-HEPE在50～200 pg/ml的濃度范圍內(nèi)以劑量依賴性抑制EC細(xì)胞HEC-1B和RL95-2的侵襲。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 圖1 18-HEPE抑制EC細(xì)胞侵襲

2.2 18-HEPE抑制EC細(xì)胞侵襲相關(guān)基因的表達(dá) 見圖2。本研究采用Western Blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察18-HEPE對EC細(xì)胞侵襲相關(guān)基因的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 pg/ml 18-HEPE明顯抑制HEC-1B和RL 95-2細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)。

圖2 18-HEPE明顯抑制EC細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)

2.3 18-HEPE抑制EC細(xì)胞IL-6的表達(dá) 見圖3。由于炎性因子在腫瘤侵襲過程中起重要的作用，本研究探討了18-HEPE 對EC細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響。實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100 pg/ml 18-HEPE能明顯抑制HEC-1B和RL 95-2細(xì)胞的IL-6表達(dá)。

圖3 18-HEPE抑制EC細(xì)胞IL-6表達(dá)(*P<0.05)

2.4 18-HEPE升高EC細(xì)胞中PTEN的表達(dá) 見圖4。由于抑癌基因PTEN缺失或突變在EC的發(fā)生發(fā)展中是極為重要的分子事件，為了進(jìn)一步探討18-HEPE抑制EC細(xì)胞侵襲的相關(guān)機(jī)制，本研究觀察了18-HEPE對EC細(xì)胞PTEN表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100 pg/ml 18-HEPE處理細(xì)胞后能明顯上調(diào)EC細(xì)胞中PTEN的表達(dá)。

3 討論

脂類代謝參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化等多種生命活動，細(xì)胞膜中脂肪酸代謝的改變(尤其是PUFAs)影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能、細(xì)胞的氧化狀態(tài)以及信號通路，從而改變細(xì)胞的特性，與腫瘤、心血管疾病和糖尿病等慢性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3,8]。Omega-3 PUFAs主要包括α-亞麻酸(α-Linolenic acid, ALA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)，ALA主要來源于核桃、亞麻子和菜籽等植物油，而EPA和DHA主要來源于深海魚油；omega-6 PUFAs主要包括亞油酸和花生四烯酸，主要存在于玉米油、葵花子油和紅花油中[9]。Omega-3 PUFAs和omega-6 PUFAs在生物體內(nèi)的代謝是一個復(fù)雜的過程，在體內(nèi)有各自的代謝途徑，但在相同的代謝步驟中所需的酶為同一酶系，存在著代謝競爭抑制，omega-3 PUFAs和omega-6 PUFAs相互影響機(jī)體合成類廿碳烷酸化合物的速度；omega-6 PUFAs的代謝產(chǎn)物具有強(qiáng)炎性作用，而omega-3 PUFAs的代謝產(chǎn)物具有低炎性作用或者具有強(qiáng)抗炎作用；在機(jī)體內(nèi)，omega-3 PUFAs拮抗omega-6 PUFAs的生理功能，以維持其體內(nèi)平衡[1]。Omega-3 PUFAs可以通過直接結(jié)合其機(jī)體細(xì)胞中的受體或者通過其衍生物、代謝產(chǎn)物影響機(jī)體細(xì)胞的特性，還可以通過降低機(jī)體局部組織的炎性水平改變腫瘤發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等多個環(huán)節(jié)，對腫瘤的防治具有重要意義[6,10-11]。

EC是一種常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，近年來，我國的EC發(fā)病率逐年升高，居女性生殖系統(tǒng)腫瘤第二位[12]。流行病學(xué)研究表明，多攝入魚或EPA/DHA明顯降低EC發(fā)生率[13-16]。Omega-3與omega-6 PUFAs比值也與EC風(fēng)險負(fù)相關(guān)[13]。小鼠接種EC細(xì)胞后，與用低omega-3 /omega-6 PUFAs比值飲食喂養(yǎng)的小鼠相比，用高omega-3/omega-6 PUFAs比值飲食喂養(yǎng)的小鼠的癌細(xì)胞中mTOR和AKT表達(dá)明顯降低[17]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DHA可以通過抑制mTORC1/2信號通路抑制EC細(xì)胞的增殖、遷移及誘導(dǎo)EC細(xì)胞凋亡，還可以抑制他莫西芬誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜生長[18]。這些研究都顯示，omega-3 PUFAs可以抑制EC的發(fā)生發(fā)展。但是目前還沒有有關(guān)omega-3 PUFAs與EC侵襲的研究報(bào)道。

本研究表明，EPA衍生物18-HEPE能抑制EC細(xì)胞的侵襲相關(guān)基因MMP-2，MMP-9的表達(dá)以及炎性因子IL-6分泌，從而抑制其侵襲。腫瘤組織局部微環(huán)境中的炎性反應(yīng)對腫瘤的侵襲有著重要作用。研究表明，IL-6可以誘導(dǎo)其下游基因(如：Cyclin D1和MMP-2等)表達(dá)，參與雌激素介導(dǎo)的EC生長與侵襲[19]。雌激素能促進(jìn)EC細(xì)胞合成分泌IL-6，分泌的IL-6上調(diào)局部組織中基質(zhì)細(xì)胞芳香化酶的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)局部組織的雌激素生物合成，這種正反饋機(jī)制在EC的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用[20]。這些結(jié)果表明，18-HEPE可以通過多種環(huán)節(jié)影響EC細(xì)胞的侵襲。在EC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中，PTEN的突變或者缺失是常見和非常重要的分子事件，PTEN可以通過PIP3-AKT信號通路抑制細(xì)胞的生長增殖、黏附侵襲和轉(zhuǎn)移；PTEN還可以通過AKT信號通路抑制NFkB活性，進(jìn)一步抑制下游炎性基因的表達(dá)，從而影響局部組織的炎性反應(yīng)[21-22]。我們的研究表明，18-HEPE可以上調(diào)EC細(xì)胞中PTEN的表達(dá)。EC細(xì)胞中PTEN表達(dá)升高可能抑制腫瘤侵襲相關(guān)基因MMP-2和MMP-9的表達(dá)以及炎癥因子IL-6的表達(dá)。至于18-HEPE如何上調(diào)EC細(xì)胞中PTEN的表達(dá)需要進(jìn)一步研究。

采用fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究表明，18-HEPE可以下調(diào)肝組織TNF-α水平，抑制肝臟的炎癥，從而抑制肝臟腫瘤的發(fā)生[23]。我們以前的研究表明，18-HEPE可以直接抑制黑色素瘤細(xì)胞CXCR4的表達(dá)和炎性反應(yīng)水平，從而抑制其肺轉(zhuǎn)移[5]。這些研究都表明，18-HEPE在預(yù)防腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，是一種重要的omega-3 PUFAs衍生物，將有廣闊的臨床應(yīng)用前景。