黃衛(wèi)彤，朱茂靈，覃衛(wèi)娟，王宗杰，廖 旺，曾貴祥

(南寧市婦幼保健院，南寧 530011)

目前國內(nèi)外報道耳聾基因GJB2突變引發(fā)兒童非綜合性耳聾概率較高[1]，主要以極重度和重度聽力損失為主。我國人群中GJB2基因最常見的致病突變位點(diǎn)為c.235del C，c.299-300 del AT，c.176-191 del l6和c.35 del G[2]，隨著耳聾基因檢測技術(shù)的發(fā)展，近年又相繼發(fā)現(xiàn) GJB2 35 del G，176 del 16，235 del C和299 del AT等新的致病突變位點(diǎn)，而且文獻(xiàn)報道[3-4]基因突變位點(diǎn)有地域差別。目前尚未見南寧市針對新生兒進(jìn)行GJB2全基因測序的研究報道,本研究旨在探討南寧市新生兒GJB2致聾基因的突變特點(diǎn)，了解基因攜帶率，篩查出與耳聾相關(guān)的基因突變位點(diǎn)，為制定適于南寧市新生兒耳聾基因篩查方案提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月～2018年12月南寧市新生兒疾病篩查中心1 007例聽力初篩未通過的新生兒為研究對象，經(jīng)知情同意和通過廣西全民健康信息平臺查看新生兒基本信息、聽力初篩、聽力損失確診等資料并跟蹤隨訪GJB基因突變者耳聾情況。聽力損失確診方法：聽性腦干反應(yīng)(ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)及聲導(dǎo)抗檢查。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑盒:DNA提取試劑為北京天根生化科技有限公司，測序試劑為TAKARA Multiplex PCR Assay Kit ver.2(寶日生物技術(shù)工程有限公司) 。

1.2.2 主要儀器：基因擴(kuò)增儀(ABI 2720),熒光定量PCR儀(ABI 7500)，測序儀(Miniseq)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：由護(hù)士采集新生兒靜脈血或足跟血，分別制成直徑8mm的3個血斑濾紙干血片并晾干，保存于-20℃冰箱，留待檢測。

1.3.2 DNA提取方法：用血片打孔器將血斑打孔得到6mm直徑的干血斑，經(jīng)萃取后，用全血基因組DNA提取試劑提取DNA，用核酸濃度檢測儀檢測DNA濃度，其最低工作濃度應(yīng)≥5ng/μl。

1.3.3 GJB2基因測序方法：①文庫構(gòu)建： PCR擴(kuò)增。② 文庫純化。③文庫質(zhì)檢：參照KAPA Library Quantification Kit Illumina platforms TDS對文庫進(jìn)行定量。④測序：將文庫pooling,變性最終以1.8 pmol/L的文庫上機(jī)測序。⑤數(shù)據(jù)分析方法：采用fastQC對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估，移除接頭污染以及平均質(zhì)量值低于20測序數(shù)據(jù)，對于總數(shù)據(jù)量低于1.2 mol/L的樣品或者平均測序深度低100×的樣品予以重新測序。運(yùn)用bwa軟件的mem 模型將測序數(shù)據(jù)與人數(shù)參考基因組(hg19)進(jìn)行比對后，通過Picard和GATK等軟件對樣品的SNV和indel進(jìn)行檢測，檢出的基因突變采用snpEff軟件進(jìn)行基因注釋和功能,通過SnpSift軟件和dbNSFP3數(shù)據(jù)庫對突變進(jìn)行功能預(yù)測。⑥生物信息學(xué)分析：利用GATK工具判讀SNP和Indel位點(diǎn)；利用Snpeff工具注釋SNP，最后利用dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫、HGMD等數(shù)據(jù)庫、clinvar數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋和比較分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，GJB2基因攜帶率以百分率(%)表示，基因突變位點(diǎn)差異性比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。待測序的GJB2突變位點(diǎn)類型分為已明確的致聾位點(diǎn)、未明確致聾位點(diǎn)(包括新基因位點(diǎn))及多態(tài)性位點(diǎn)三種類型。

2 結(jié)果

GJB2各突變位點(diǎn)、攜帶率及GJB2c.109 G>A攜帶率與其它城市比較結(jié)果分別詳見表1，表2。 1 007例新生兒中GJB2致聾基因攜帶率為55.21%(556/1 007)，共檢測出GJB2突變位點(diǎn)16個，其中GJB2 c.109 G>A 突變攜帶率較高，占20.36%，其次是c.79 G>A 占10.03%，c.608 T>C 占7.65%，c.217 C>A 占7.15%，c.341 A>G 占6.85%，其它位點(diǎn)(包括c.11 G>A ，-23+1 G>A， c.235del C， c.299 del AT，c.-121 G>A ，c.464 A>G，c.147 C>G， c.676 G>T ，c.316 T>G ，c.-23-35 G>T和c.368 C>A)突變攜帶率<0.1%。通過廣西全民健康信息平臺查看556例GJB2攜帶者基本信息、聽力初篩、聽力損失確診資料和跟蹤隨訪結(jié)果，有31例確診聽力損失(不同程度耳聾)，基因突變致聾率為5.58%。其中檢出GJB2致聾突變位點(diǎn)包括 c.109 G>A(純合子突變)，c.235del C(純合子突變)， c.299 del AT(純合子突變)和c.11 G>Ac(雜合子突變)，分別占耳聾率的83.87%，6.45%，3.23%和6.45%。81例聽力確診正常者檢出6個新突變位點(diǎn)，包括c.-23-35 G>T ，c.-121 G>A ，c.464 A>G， c.217 C>A，c.147 C>G和c.676 G>T。4例檢出1個未明確致病性位點(diǎn)是c.-23+1 G>A 。250例確診聽力正常者攜帶其它5個突變位點(diǎn)為中國人群最常見多態(tài)突變位點(diǎn)。GJB2 c.109 G>A攜帶率與北京[5]、臺灣[6]和上海[7]比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=133.364,11.724,32.449,均P<0.05)，與廣東[8]比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.085，P>0.5)。

3 討論

3.1 研究結(jié)果顯示 南寧市新生兒GJB2攜帶率高達(dá)55.21%，基因突變致聾率為5.58%，致聾率與國內(nèi)報道基本一致[2]。篩查出4個致聾突變位點(diǎn)中，c.109 G>A攜帶率最高，與北京、上海等城市比較有地域性差別。GJB2 c.109 G>A純合子突變者均確診為不同程度耳聾，占致聾突變位點(diǎn)的83.87%，與國內(nèi)外戴翔等報道比較偏高[4，9]，其次是c.235 delC，c.299 del AT純合子突變和c.11 G>A雜合子突變均可致聾，但比戴翔等報道[4]攜帶率偏低。說明南寧市新生兒攜帶的致聾基因以GJB2 c.109 G>A為主，其它致聾突變位點(diǎn)攜帶率比較低。國外有報道[9-11]GJB2 c.-23+1 G>A為致聾位點(diǎn)，國內(nèi)未見報道，本研究4例攜帶者為c.-23+1 G>A雜合子突變，聽力正常，由于病例少，未檢出純合子突變，需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量檢測，才能深入研究證實(shí)該位點(diǎn)純合子突變是否致聾。

表1 1 007例新生兒耳聾基因GJB2檢測各位點(diǎn)突變攜帶率(n=100)

表2GJB2c.109G>A攜帶率與其它城市結(jié)果比較[n(%)]

類別n攜帶率n(%)χ2P值 南寧[本研究]1 007205(20.36)——北京[5]91536(3.93)133.3640.000臺灣[6]5 173821(15.87)11.7240.001上海[7]1 516181(11.94)32.4490.000廣東[8]53 03310 995(20.73)0.0850.771

3.2 250例攜帶GJB2突變位點(diǎn) 國內(nèi)報道[4-5，12]c.368 C>A，c.316 T>G，c.341 A>G，c.79 G>A和c.608 T>C為中國人群最常見多態(tài)突變，結(jié)合聽力確診和追蹤隨訪結(jié)果，攜帶者聽力正常，提示以上5個突變位點(diǎn)攜帶者致聾風(fēng)險機(jī)率很低。

3.3 GJB2突變的新位點(diǎn)與致病情況 研究有81例檢出6個新突變位點(diǎn)，包括c.-23-35 G>T ，c.-121 G>A ，c.464 A>G， c.217 C>A，c.147 C>G和c.676 G>T，結(jié)合聽力確診和追蹤隨訪結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)聽力損失，但均為雜合子突變，還不能證實(shí)其是否致聾，需要繼續(xù)收集樣本檢測，才能確定純合子突變與耳聾相關(guān)性。

綜上所述，本研究依據(jù)1 007例南寧市新生兒跟蹤隨訪、聽力篩查、確診和高通量測序血液中GJB2基因突變結(jié)果，篩查出4個致聾突變位點(diǎn)和6個新突變位點(diǎn)，1個未明確致病位點(diǎn)，明確了南寧市新生兒GJB2致聾基因攜帶率較高，致聾突變位點(diǎn)以c.109 G>A純合子突變?yōu)橹?，為制定適合于南寧市新生兒耳聾基因篩查方法和遺傳咨詢提供可靠依據(jù)。