劉堅 龍婷婷 李晨彥

[摘要] 目的 探討人臍帶血間充質干細胞（hUC-MSC）對脂多糖（LPS）誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞（AECⅡ）凋亡的影響，及MEK/ERK信號通路在其中的作用。 方法 采用LPS與A549細胞共培養(yǎng)建立AECⅡ凋亡模型;將凋亡模型按隨機數(shù)字表法分成6組，分別與MSC條件培養(yǎng)基（MSC-CM）、MEK/ERK通路抑制劑（PD98059）及PBS體外共培養(yǎng)，分別為A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+LPS+PD98059，陰性對照組為A549+PBS、A549+MSC、A549+PD98059，48 h后采用流式細胞術檢測A549細胞凋亡情況;對MEK/ERK通路及凋亡相關信號（BAX/BCL-2、FAS、caspase 3及caspase 8）進行qPCR檢測，對A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+PBS、A549+MSC四組組進行Western blot檢測。 結果 建立A549+LPS凋亡模型。A549+LPS+MSC、A549+LPS+PD98059組與A549+LPS+PBS比較，凋亡率顯著下降。A549+LPS+MSC及A549+LPS+PD98059的MEK、ERK、BAX/BCL-2、caspase 3及caspase 8 mRNA擴增倍數(shù)均顯著低于A549+LPS+PBS（P < 0.05），而蛋白水平上FAS、BAX、cleaved Caspase 3、p-MEK、p-ERK、A549+LPS+MSC較A549+LPS+PBS明顯降低（P < 0.05），而TNF-R1差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結論 hUC-MSCs可能通過旁分泌作用抑制MEK/ERK信號通路磷酸化，影響內源性線粒體及外源性FAS/FASL途徑進而減輕LPS誘導的AECⅡ凋亡。

[關鍵詞] 間充質干細胞;細胞外信號調節(jié)激酶;凋亡;肺泡Ⅱ型上皮細胞;脂多糖

[中圖分類號] R563? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）02（c）-0013-06

[Abstract] Objective To discuss the effect of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells （hUC-MSC） on alveolar type Ⅱ epithelial cells （AEC Ⅱ） apoptosis induce by lipopolysaccharide （LPS）， and the role of MEK/ERK signaling pathway. Methods The AECⅡ apoptosis model was established by LPS co-cultured with A549 cells. The apoptosis model was randomly divided into 6 groups according to random number method， they were co-cultured with MSC conditioned medium （MSC-CM）， MEK/ERK pathway inhibitor （PD98059） and PBS， which were named A549+LPS+MSC， A549+LPS+PBS， A549+LPS+PD98059， and the negative control groups were A549+PBS， A549+MSC， A549+PD98059. Apoptosis of A549 cells was detected by Annexin V/PI staining flow cytometry 48 h later. MEK/ERK pathway and apoptosis-related signals （BAX/BCL-2， FAS， caspase 3 and caspase 8） were examined by qPCR. The groups of A549+LPS+MSC， A549+LPS+PBS， A549+PBS， and A549+MSC were selected for Western blot detecting. Results The apoptosis model was established by A549+LPS. Compared with A549+LPS+PBS， the apoptosis rate of A549+LPS+MSC and A549+LPS+PD98059 were decreased significantly （P < 0.05）. The mRNA expression levels of MEK， ERK， BAX/BCL-2， caspase 3 and caspase 8 in A549+LPS+MSC and A549+LPS+PD98059 were significantly lower than those in A549+LPS+PBS （P < 0.05）. The expression of FAS， BAX， cleaved Caspase 3， p-MEK， and p-ERK protein in the A549+LPS+MSC and A549+LPS+PD98059 were significantly lower than A549+LPS+PBS（P < 0.05）. There was no significant different in TNF-R1 among each group （P > 0.05）. Conclusion hUC-MSCs may inhibit the phosphorylation of MEK/ERK signaling pathway affecting mitochondria pathway and FAS/FASL pathway by paracrine action， thereby attenuating apoptosis of AECⅡ induced by LPS.

[Key words] Mesenchymal stem cells; Extracellular signal-regulated kinases; Apoptosis; Alveolar type Ⅱ epithelial cells; Lipopolysaccharide

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）常繼發(fā)于膿毒癥，死亡率高（30%～40%），發(fā)病機制復雜，尚缺乏有效的治療措施[1-2]。膿毒癥釋放大量炎癥因子，肺泡上皮細胞損傷甚至凋亡是ARDS的病理、生理基礎[3-4]。ARDS中肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar epithelial type Ⅱ cell，AECⅡ）的凋亡是AEC死亡的主要機制之一[5]。細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）在細胞的分化、增殖及凋亡中起關鍵作用[6-7]，本課題組前期已在膿毒癥所致ARDS動物模型中發(fā)現(xiàn)MEK/ERK途徑的磷酸化影響著AECⅡ凋亡[8]。

因人臍帶血來源間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC）有著較高的分化潛能及多種生物學作用，可改善膿毒癥引起的ARDS[9-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MSC能夠改善膿毒癥所致ARDS小鼠中AECⅡ凋亡。本研究選用人類肺泡細胞癌來源并且具有類似AECⅡ代謝特征和形態(tài)學特征的A549細胞[13]進行研究，有望從體外試驗明確MSC對AECⅡ凋亡在信號通路上的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株：A549細胞株由中國科學院細胞庫提供。儀器：流式細胞儀（FACSCalibur，BD）;熒光定量PCR儀（7300，ABI）。試劑：LPS（L8880，Solarbio）細胞培養(yǎng)基（RPMI 1640 Hyclone）;總RNA提取試劑Trizol Reagent（15596-026，Invitrogen Life Technologies）;第一鏈cDNA合成試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（#K1622，Thermo）;山羊抗兔cleaved Caspase3單克隆抗體（bs-1518，Abcam），凱基Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（KGA08，凱基生物）;PCR引物（Invitrogen Biotechnology Co.，LTD）;cleaved-caspase8（10380-1-AP，PTG）;bcl-2（2870S，CST）;bax（1163，EPI）;TNF-R1（ab2143，Abcam）;p-MEK（ab96379，Abcam）;ERK（4371，bioworld）;p-ERK（4371，cst）;MEK（bs-1041R，BIOSS）;β-actin（sc-1616R，Santa）;Pro-caspase3（bs-1518，Bioworld）;FAS（sc-1023，Santa）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

hUC-MSCs為湘潭市中心醫(yī)院生殖中心從人臍帶血中分離取得，細胞標記及分化潛能在本課題組前期研究中已證實[14]。

1.2.2 建立A549凋亡模型

將對數(shù)生長期細胞消化后，按4000細胞/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h貼壁。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按隨機數(shù)字法分為3組，對照組為正常培養(yǎng)的A549細胞;實驗組細胞中分別加入不同濃度的 LPS（10、20 μg/mL）并刺激48 h，選擇凋亡水平最高的LPS濃度，建立A549凋亡模型。

1.2.3 Annexin-V-FITC/PI染色流式細胞術檢測A549細胞凋亡率

分別將A549細胞在對照組培養(yǎng)基和hUC-MSC條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。將細胞消化，離心，去上清。加入1×結合緩沖液400 μL重懸細胞，加入5 μL Annexin-V-FITC混勻，室溫避光15 min。加入10 μL PI混勻，冰浴避光5 min。1 h內Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測，PI紅色熒光通過PI通道（FL2）檢測。

1.2.4 檢測MSC及MEK/ERK通路抑制劑（PD98059）對LPS誘導A549凋亡的影響

將對數(shù)生長期A549細胞用胰蛋白酶消化，按4000細胞/孔接種于96孔板，按隨機數(shù)字表分成6組，每組16孔，實驗組為A549+LPS+MSC、A549+LPS+PD98059，對照組為A549+LPS+PBS，陰性對照組為A549+MSC、A549+PD98059、A549+PBS。48 h后Annexin-V-FITC/PI染色流式細胞術檢測三組細胞凋亡的改變情況。

1.2.5 Rt-PCR及Western blot檢測MEK/ERK通路相關基因及蛋白的表達

對6組細胞進行qPCR檢測，取A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+MSC、A549+PBS行Western blot檢測。

1.2.5.1 Rt-PCR定量檢測? MEK及ERK、BAX、BCL-2、TNF-R1、FAS、caspase 3、caspase 8的mRNA水平? 分別收集各組A549細胞，從細胞中分離總RNA，采用Trizol Reagent（Invitrogen Life Technologies），從各細胞樣本中取總RNA 5 μg，反轉錄成cDNA。Rt-PCR篩選候選基因及采用β-actin作為內參。使用Primer Express 2.0軟件設計各引物基因序列，β-actin上游引物為5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′，下游引物為5′-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′，BAX上游引物為5′-GCCTTTTGCTACAGGGTTCAT-3′，下游引物為5′-TATTGCTGTCAGTTCATCTCCA-3′，BCL2上游引物為5′-TGACTCTCTCGTCGCTACCGT-3′，下游引物為5′-CCTGAAGAGTTCCTCCACACC-3′，CASP3上游引物為5′-GTCTGACTGGAAAGCCGAA-AC-3′，下游引物為5′-GACTGGATGAACCACGACCC-3′，F(xiàn)AS上游引物為5′-GAAGAGACCCCTGTGG-TATTTGA-3′，下游引物為5′-ACACTTTTCCGCTCACAATCAGA-3′。采用Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）（Roche）在熒光定量PCR儀（7300）完成操作。

1.2.5.2 Western blot檢測? 采用Western blot檢測其中A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+PBS、A549+MSC四組細胞內FAS、BAX、BCL-2、TNF-R1、caspase 3、cleaved caspase 3、p-MEK、p-ERK表達水平。細胞總蛋白提取，使用RIPA裂解緩沖液提取蛋白質，并對蛋白質含量進行定量。將樣品（30 μg等蛋白）進行SDS-PAGE，然后轉移到PVDF膜上。針對FAS、BAX、BCL-2、TNF-R1、caspase 3、cleaved caspase 3、p-MEK、p-ERK的一抗探測探針，隨后與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的抗兔二抗（1∶2000）。采用兔單克隆抗β-actin作為上樣對照。Quantity One軟件分析各蛋白條帶灰度值。以目標蛋白與內參β-actin灰度值比值代表各蛋白的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AECⅡ凋亡體外模型探索

Annexin-V-FITC/PI染色流式細胞術檢測各組細胞凋亡結果，如圖1所示，因隨著LPS濃度繼續(xù)增大，A549細胞以壞死為主[15]，故采用LPS（20 μg/mL）建立誘導A549凋亡模型。

2.2 hUC-MSC和PD98059干預后對LPS誘導的A549凋亡影響

與A549+LPS+PBS比較，A549+LPS+MSC及A549+LPS+PD98059的A549凋亡率顯著下降（P < 0.05）。見圖2。

2.3 MSC對MEK/ERK通路相關基因及蛋白的表達水平的影響

2.3.1 Rt-PCR定量檢測MSC抑制MEK/ERK通路相關基因mRNA表達情況

A549+LPS+MSC、A549+LPS+PD98059中A549細胞內BAX、CASPASE 3、CASPASE 8、MEK、ERK的mRNA擴增倍數(shù)水平低于A549+LPS+PBS，而BCL-2高于A549+LPS+PBS（P < 0.05）。A549+LPS+PD98059與A549+LPS+PBS的FAS mRNA擴增倍數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。而A549+LPS+MSC、A549+LPS+PD98059TNF-R1 mRNA擴增倍數(shù)與A549+LPS+PBS組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖3。

2.4 MSC對MEK/ERK通路及凋亡相關信號表達水平的影響

選擇 A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+PBS、A549+MSC 進行Western blot檢測，BAX及cleaved-caspase 3的蛋白水平，A549+LPS+MSC較A549+LPS+PBS下調（P < 0.05）。與A549+LPS+PBS比較，A549+LPS+MSC的p-MEK及p-ERK水平、p-MEK/t-MEK、p-ERK/t-ERK比值均降低（P < 0.05），而各組TNF-R1差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖4。

3 討論

本研究驗證了hUC-MSCs可以改善LPS誘導的AECⅡ的凋亡水平，其通過旁分泌改變細胞微環(huán)境來抑制FAS/FASL系統(tǒng)及內源性線粒體凋亡途徑的激活，而MEK/ERK信號在其中扮演重要角色。

MEK/ERK是Ras絲裂原信號轉導下游的核心元件，在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，當細胞外刺激物（如LPS、細胞因子）與相應受體結合后，SOS與受體或受體底物上的酪氨酸（Tyr）磷酸化位點結合，在Ras附近形成高濃度的SOS，其促使GTP取代Ras上的GDP而活化Ras，使MEK催化區(qū)中Thr和Ser磷酸化激活MEK，發(fā)揮調控細胞凋亡的作用[16-17]。根據(jù)之前本課題組研究發(fā)現(xiàn)的膿毒癥所致ARDS中AECⅡ凋亡的機制與MEK/ERK磷酸化相關[8]，結合此次體外研究結果，即在LPS誘導A549凋亡模型中，p-MEK/p-ERK蛋白表達增高，本研究認為可能是LPS激活Ras/MEK/ERK信號通路，促進MEK和ERK磷酸化，進而導致細胞色素C的大量釋放，形成凋亡體后激活caspase 3，爆發(fā)級聯(lián)反應，最終導致AECⅡ凋亡[18-19]。

MSC通過旁分泌各種生長因子，彌補損傷情況下生物多樣性重要成分，發(fā)揮調節(jié)如NF-κB、PI3K/AKT等重要信號通路的活性，從而改善凋亡的作用[9，20]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，通過MSC-CM及PD98059與LPS誘導A549共培養(yǎng)，A549凋亡情況均改善，同時MSC與PD98059一致，其Bax/Bcl-2、Fas及MEK、MRK在基因水平與對照組存在明顯差異。且經MSC及PD98059干預后，Bax/bal-2的比例及caspase 3也較對照組明顯下調。結合MSC干預組的BAX和FAS在蛋白水平的表達上顯著低于對照組，且p-MEK和p-ERK的蛋白表達同樣弱于對照組，充分說明MSC極有可能是通過抑制MEK/ERK信號通路的磷酸化，從而抑制AECⅡ的凋亡，但其上游相關信號（Raf/Ras）如何調控MEK/ERK的活化尚需進一步的驗證。

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（收稿日期：2019-10-09? 本文編輯：任? ?念）