張倩 孫永紅 文世民

[摘要] 目的 探討miRNA-675-5p表達(dá)水平與食管鱗癌（ESCC）上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的相關(guān)性。 方法 采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-675-5p在ESCC組織及配對(duì)癌旁正常組織中的表達(dá)差異，并分析其表達(dá)水平與患者臨床分期的相關(guān)性。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ECA109細(xì)胞，分為miR-675-recursor組、miR-675-5p-inhibition組和NC組，上調(diào)及抑制miRNA-675-5p表達(dá)水平，分析改變目的基因表達(dá)后對(duì)ECA109細(xì)胞株遷移侵襲能力的影響，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾表達(dá)每組細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平，評(píng)估其對(duì)ECA109株EMT過程的影響。 結(jié)果 與癌旁正常組織比較，miRNA-675-5p在ESCC組織中表達(dá)顯著升高（P < 0.05），不同分期患者miRNA-675-5p表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與NC組比較，miR-675-recursor組細(xì)胞遷移侵襲能力明顯增強(qiáng)，miR-675-5p-inhibition組細(xì)胞遷移侵襲能力受到顯著抑制（P < 0.05）。此外，與NC組比較，miR-675-recursor組E-cadherin蛋白表達(dá)降低，N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)升高;miR-675-5p-inhibition組E-cadherin蛋白表達(dá)升高，N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)降低（P < 0.05）。 結(jié)論 miRNA-675-5p表達(dá)與ESCC患者TNM分期相關(guān)，miR-675-5p能促進(jìn)ESCC細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而增強(qiáng)侵襲能力;下調(diào)表達(dá)能逆轉(zhuǎn)ESCC細(xì)胞EMT過程，降低遷移侵襲能力。

[關(guān)鍵詞] 食管鱗癌;ECA109細(xì)胞;miRNA-675-5p;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

[中圖分類號(hào)] R735.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）02（a）-0018-05

[Abstract] Objective To investigated the correlation between the expression of miRNA-675-5p and epithelial-mesenchymal transition （EMT） in esophageal squamous cell carcinoma （ESCC）. Methods Real-time quantitative PCR was used to detect the differential expression of miRNA-675-5p in ESCC and normal adjacent tissues， while the correlation between its expression level and clinical stage of patients was analyzed. Liposomes was transfected into ECA109 cell， and divided into miR-675-recursor group， miR-675-5p-inhibition group and NC group. The expression of miRNA-675-5p was up-regulated and inhibited， while the effect of changing the expression of the target gene on the migration and invasion of ECA109 cell lines was analyzed. The expression levels of E-cadherin， N-cadherin， and Vimentin in EMT-associated proteins in each group of cells were detected by western blot experiments， while the effect on the EMT process of ECA109 strain was evaluated. Results Compared with normal adjacent tissues， miRNA-675-5p expression was significantly increased in ESCC tissues （P < 0.05）， and comparison of miRNA-675-5p expression in patients with different stages， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with the NC group， the miR-675-recursor group had significantly enhanced cell migration and invasion ability， and the miR-675-5p-inhibition group had significantly reduced cell migration and invasion ability （P < 0.05）. In addition， compared with the NC group， the expression of E-cadherin protein in the miR-675-recursor group was reduced， while the expression of N-cadherin and Vimentin proteins were increased; the expression of E-cadherin protein in the miR-675-5p-inhibition group was increased， while the expression of N-cadherin and Vimentin proteins were reduced （P < 0.05）. Conclusion The expression of miRNA-675-5p is related to the TNM stage of ESCC patients. miR-675-5p can promote the interstitial transformation of ESCC cells and thus enhance the invasion ability; down-regulated expression can reverse the EMT process of ESCC cells and reduce the migration and invasion ability.

[Key words] Esophageal squamous cell carcinoma; ECA109 cells; miRNA-675-5p; Epithelial mesenchymal transition

我國(guó)食管癌新發(fā)患者大約23萬人/年，占全世界發(fā)病人數(shù)的53%[1-2]，90%以上為鱗狀細(xì)胞癌。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致我國(guó)食管鱗癌（ESCC）患者生存率低下的主要原因[3]，ESCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未明確，亟需探索新的分子標(biāo)志物，預(yù)測(cè)ESCC預(yù)后及指導(dǎo)個(gè)體化治療。miRNAs長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸，miRNAs轉(zhuǎn)錄后抑制信使RNA翻譯蛋白質(zhì)。miR-675-5p是長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19的成熟序列，位于人染色體11p15.5，胎兒時(shí)期表達(dá)量最高，分娩后組織器官中表達(dá)急速下降，最終穩(wěn)定低表達(dá)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-675-5p在多種實(shí)體腫瘤中異常表達(dá)，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[3]、結(jié)腸癌、膀胱癌及胃癌等[5-9]中表達(dá)升高，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞株增殖或轉(zhuǎn)移。90%以上腫瘤患者死亡原因是轉(zhuǎn)移，腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[10]，即上皮源性腫瘤細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)細(xì)胞特性轉(zhuǎn)化，從原發(fā)灶逃離進(jìn)入脈管，發(fā)生淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移。張航等[11]發(fā)現(xiàn)食管癌轉(zhuǎn)移病灶中miR-675-5p表達(dá)水平升高，且與患者生存時(shí)間成負(fù)相關(guān)。miR-675-5p能否促進(jìn)食管鱗癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，與食管鱗癌細(xì)胞EMT過程是否存在關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 細(xì)胞株和組織

ESCC細(xì)胞株ECA109、TE-1（ATCC），人食管上皮細(xì)胞Heepic（ScienCell）。細(xì)胞均用含10%胎牛血清（Hyclone，美國(guó)）、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)）培養(yǎng)。組織來源于2018年1～12月四川省南充市中心醫(yī)院和川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科行食管鱗癌切除術(shù)21例，術(shù)前均未接受放化療及靶向治療。切除腫瘤及癌中心5 cm以上癌旁正常組織?；颊咝g(shù)后病理分期采取美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）第8版標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

ECA109細(xì)胞轉(zhuǎn)染分為miR-675-recursor組、miR-675-5p-inhibition組和NC組。質(zhì)粒裝載miR-675-5p類似物（miR-675-recursor）、抑制片段（miR-675-5p-inhibition）、陰性對(duì)照片段（NC），片段均合成于上海吉?jiǎng)P公司，LipofectamineTM 2000（Invitrogen，美國(guó)）。轉(zhuǎn)染前24 h用6孔板進(jìn)行細(xì)胞鋪板（鋪板細(xì)胞數(shù)25×104個(gè)/孔），siRNA∶LipofectamineTM2000=1∶1.5，按照說明書操作，轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞。重復(fù)9次。

1.3 方法

1.3.1 定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反映（qRT-PCR）檢測(cè)目的基因表達(dá)

總RNA提取為超凈環(huán)境，器材均無菌無RNA酶。組織冰上剪去筋膜，滅菌超純水洗凈，取黃豆大小于研磨器中倒入適量液氮研磨成組織漿，加入750 μL Trizol。后續(xù)步驟按說明書操作?？俁NA濃度要求 ≥700 ng/μL，1.90

miRNA逆轉(zhuǎn)錄采用莖環(huán)法，引物購(gòu)自銳博公司，mRNA引物由上海生物科技有限公司合成，引物序列見表1，miRNA及mRNA分別選擇U6、β-actin為內(nèi)參基因。qRT-PCR試劑盒SYBR TaqⅡ（TAKARA，美國(guó)，生產(chǎn)批號(hào)：DRR041A），逆轉(zhuǎn)錄及PCR均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，每基因、樣本均3個(gè)復(fù)孔。優(yōu)化反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性600 s;95℃變性2 s，60℃退火20 s和70℃延伸10 s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)量用2-△△ct計(jì)算。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)目的基因蛋白表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞加入裂解液進(jìn)行總蛋白提取，100℃使蛋白變性，變性后蛋白進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜、抗原抗體反應(yīng)，ECL超特敏化學(xué)發(fā)光試劑盒，在熒光成像儀內(nèi)對(duì)目的蛋白進(jìn)行成像檢測(cè)，Image Lab凝膠圖像軟件分析。

1.3.3 細(xì)胞遷移侵襲能力檢測(cè)

Transwell：稀釋Matrigel基質(zhì)膠于Transwell小室上室，室溫下凝固后備用。收集轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞制備成105 mL單細(xì)胞懸液，下室加入不含雙抗的完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清），上室加入200 μL細(xì)胞懸液，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。固定，透明，結(jié)晶紫染色，高倍鏡下隨機(jī)觀察16個(gè)視野并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及統(tǒng)計(jì)圖表繪制。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；蛞种?上調(diào)率為干擾后目的基因表達(dá)量與陰性對(duì)照組（NC）表達(dá)量的相對(duì)差異百分比。

2 結(jié)果

2.1 miR-675-5p在腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量

與癌旁正常組織比較，ESCC組織miRNA-675-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。ECA109細(xì)胞株和TE-1細(xì)胞株miRNA-675-5p相對(duì)表達(dá)量顯著高于Heepic細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 ESCC患者臨床特征與miR-675-5p表達(dá)水平比較

不同T分期、N分期及病理分期患者miR-675-5p表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而不同年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)度和神經(jīng)受侵患者miR-675-5p表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

2.2 轉(zhuǎn)染后ECA109細(xì)胞miR-675-5p相對(duì)表達(dá)量

綠色熒光細(xì)胞即為轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/白色背景細(xì)胞數(shù)（同一視野下）。本實(shí)驗(yàn)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ECA109，轉(zhuǎn)染效率>90%。見圖2。轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)，miR-675-recursor組、miR-675-5p-inhibition組、NC組相對(duì)表達(dá)量依次為1.350（上調(diào)率為68.8%）、0.069（抑制率為89.1%）、0.800。見表4。

2.3 干擾miR-675-5p表達(dá)后ECA109細(xì)胞株侵襲能力

miR-675-recursor組細(xì)胞穿膜數(shù)約為278個(gè)/HP，miR-675-5p-inhibition組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)為95個(gè)/HP，NC組細(xì)胞穿膜個(gè)數(shù)為187個(gè)/HP。與NC組比較，miR-675-recursor組表達(dá)ECA109遷移侵襲能力明顯增強(qiáng)，miR-675-5p-inhibition組細(xì)胞遷移侵襲能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3。

2.4 目的基因?qū)MT蛋白表達(dá)影響

與NC組比較，miR-675-recursor組E-cadherin表達(dá)顯著降低，N-cadherin、Vimentin表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;miR-675-5p-inhibition組E-cadherin表達(dá)顯著升高，N-cadherin、Vimentin表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

ESCC嚴(yán)重威脅我國(guó)人民生命健康，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致ESCC患者生存低下的主要原因，因此亟需明確ESCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分子機(jī)制[12]。編碼蛋白質(zhì)基因僅僅占基因總量的2%[13-14]，非編碼RNA是基因表達(dá)重要的調(diào)節(jié)因子[15]。其中miRNA最先被研究者發(fā)現(xiàn)具有沉默mRNA、抑制mRNA翻譯蛋白質(zhì)的功能，主要參與蛋白質(zhì)沉默復(fù)合體形成[16]。近年來研究者發(fā)現(xiàn)miRNA還能催化mRNA降解，誘導(dǎo)mRNA不穩(wěn)定性，直接抑制基因轉(zhuǎn)錄后翻譯[17]，調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT是獲得轉(zhuǎn)移侵襲能力的重要途徑[18]，H19可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-675-5p表達(dá)水平與ESCC病理分期顯著相關(guān)，猜測(cè)可能通過影響ESCC的EMT發(fā)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，目的基因可促進(jìn)ESCC的ECA109細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移侵襲能力。EMT發(fā)生的經(jīng)典信號(hào)通路包括Snail/Slug、Twist、Six1、Cripto、TGF-β和nt/β-catenin等[19]，多種信號(hào)通路途徑可以促進(jìn)腫瘤EMT發(fā)生，但不同腫瘤細(xì)胞主要采取不同種信號(hào)通路。miRNAs調(diào)節(jié)多能干細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化，其中miR-200s與miR-205可抑制ZEB1和ZEB2表達(dá)激活骨形成蛋白信號(hào)通路誘導(dǎo)多能干細(xì)胞MET過程[20]。在ESCC中miR-675是如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，因此仍需進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

總之，miR-675-5p在ESCC組織及細(xì)胞中均顯著高表達(dá)，且表達(dá)水平越高的患者，病理分期更晚，更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示表達(dá)水平可預(yù)測(cè)ESCC患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床中根據(jù)表達(dá)狀態(tài)對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化治療，下調(diào)miR-675-5p的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT過程。因此，有望成為ESCC治療的新靶點(diǎn)。miRNA能在血液中穩(wěn)定存在，ESCC患者血液樣本是否能得出同樣的結(jié)論，仍待進(jìn)一步證實(shí)。

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（收稿日期：2019-07-16? 本文編輯：王曉曄）