楊馭媒，劉小琦，李新麗，鄭永利

(1.成都市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610051；2.四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610072；3.成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心，四川成都 610066)

慢性丙型肝炎(CHC)是臨床常見的感染性疾病，其病理改變與乙型肝炎極為相似，包括肝細(xì)胞壞死和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。隨病情進(jìn)展CHC患者可發(fā)生肝硬化，并且發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。丙型肝炎病毒(HCV)主要通過輸血、針刺以及母嬰等方式傳播，目前國(guó)內(nèi)抗病毒治療方案仍以干擾素和利巴韋林聯(lián)合用藥為主，其療效受病毒和宿主等多方面因素影響，因此需要一種安全、無(wú)創(chuàng)的方法來評(píng)估治療效果和病情進(jìn)展情況[2-3]。微小RNA(miR)是長(zhǎng)度約20～25個(gè)核苷酸序列的非編碼RNA，可以抑制靶基因mRNA的表達(dá)，從而參與細(xì)胞周期調(diào)控、胚胎發(fā)育及免疫預(yù)防等生理活動(dòng)。最新的研究表明，miR在肝臟病理機(jī)制和生理功能的調(diào)控中有重要作用，其中miR-122和miR-222在病毒性肝炎患者中水平明顯上調(diào)，可能參與了肝星形細(xì)胞(HSC)的活化和肝纖維化的進(jìn)展，監(jiān)測(cè)血清miR-122、miR-222水平變化對(duì)治療和病情評(píng)估有重要參考價(jià)值[4-6]。本研究主要分析了CHC患者血清miR-122、miR-222水平及其與肝功能和肝組織病理改變的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016年2月至2019年2月在成都市公共衛(wèi)生醫(yī)療中心進(jìn)行治療的CHC患者共173例納入研究作為CHC組，男95例、女78例，年齡19～57歲、平均(42.61±9.08)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》中CHC診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)年齡18～60歲；(3)完成經(jīng)皮肝組織穿刺活檢；(4)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴其他病毒性肝炎或HIV感染；(2)伴肝臟腫瘤、脂肪肝及膽汁淤積癥等其他原發(fā)或繼發(fā)性肝??；(3)此前6個(gè)月內(nèi)曾行抗病毒或免疫調(diào)節(jié)治療；(4)肝移植患者；(5)肝組織活檢不符合標(biāo)準(zhǔn)者。另外，選取同期體檢合格的健康者120例作為對(duì)照組，男71例、女59例，年齡18～60歲、平均(43.29±8.76)歲。兩組人群年齡、性別等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 采集上述兩組人群空腹外周靜脈血2管各3 mL，3 500 r/min離心5 min，取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆?，一管采用日?600-020型全自動(dòng)生化儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、血清清蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)水平；一管采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)進(jìn)行miR-122、miR-222水平的檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司。檢測(cè)步驟：先用miRNAVana PARIS試劑盒(美國(guó)Ambion公司)提取和純化miR，然后以特異性莖環(huán)引物(Applied Biosystems公司)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后以miRNA-16為內(nèi)參檢測(cè)和計(jì)算miR-122及miR-222相對(duì)表達(dá)水平，所有操作均嚴(yán)格按照說明書要求完成。

1.2.2肝臟組織病理檢查 通過彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)(Philips HD7EX型)引導(dǎo)，經(jīng)皮穿刺獲取長(zhǎng)度>1 cm的肝組織，10%甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木精染色后由3位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師根據(jù)《病毒性肝炎防治方案》進(jìn)行閱片和診斷，肝炎活動(dòng)度分級(jí)[8]：G0為無(wú)炎癥；G1為匯管區(qū)炎癥；G2為輕度匯管區(qū)周邊碎屑樣壞死(PN)或灶性壞死；G3為中度PN；G4為重度PN或橋樣壞死。肝纖維化分期：S0為無(wú)纖維化；S1為擴(kuò)大的匯管區(qū)纖維化；S2為匯管區(qū)周圍纖維化但小葉結(jié)構(gòu)保留；S3為纖維化伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂；S4為肝硬化。

2 結(jié) 果

2.1兩組人群肝功能指標(biāo)的比較 CHC組血清ALT、AST、GGT、ALP及TBIL水平均高于對(duì)照組，血清ALB水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2兩組人群血清miR-122、miR-222水平的比較 CHC組血清miR-122和miR-222水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3不同肝炎活動(dòng)度分級(jí)的CHC患者血清miR-122、miR-222水平比較 隨著肝炎活動(dòng)度分級(jí)增加，CHC患者血清miR-122和miR-222水平明顯升高(P<0.05)，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表1 兩組人群肝功能指標(biāo)的比較

表2 兩組人群血清miR-122、miR-222水平的比較

表3 不同肝炎活動(dòng)度分級(jí)CHC患者血清miR-122、miR-222水平比較

注：與G0比較，aP<0.05；與G1比較，bP<0.05；與G2比較，cP<0.05；與G3比較，dP<0.05。

2.4不同肝纖維化分期CHC患者血清miR-122、miR-222水平比較 隨著肝纖維化分期增加，患者血清miR-122水平明顯降低(P<0.05)，血清miR-222水平明顯升高(P<0.05)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同肝纖維化分期CHC患者血清miR-122、miR-222水平比較

注：與S0比較，aP<0.05；與S1比較，bP<0.05；與S2比較，cP<0.05；與S3比較，dP<0.05。

2.5miR-122、miR-222與肝功能、肝炎活動(dòng)度及肝纖維化的相關(guān)性分析 血清miR-122水平與ALB和肝纖維化分期呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，與肝炎活動(dòng)度呈正相關(guān)性(P<0.05)；血清miR-222水平與ALT、ALB、肝炎活動(dòng)度及肝纖維化分期均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 miR-122、miR-222與肝功能、肝炎活動(dòng)度及肝纖維化相關(guān)性分析

3 討 論

CHC是世界范圍內(nèi)廣泛流行的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率雖然低于慢性乙型肝炎，但近年來呈明顯上升趨勢(shì)。全球HCV感染率約為3%，感染者數(shù)量超過1.7億，發(fā)展中國(guó)家占90%，其中55%～85%進(jìn)展為慢性感染且5%～15%的患者可在感染20年后進(jìn)展為肝硬化，威脅患者生命安全[9-10]。目前，肝病進(jìn)展情況評(píng)價(jià)仍依賴于肝組織穿刺活檢，對(duì)人體損傷較大，患者耐受性較差，難以重復(fù)開展，因此尋找非侵入性的肝組織損傷和纖維化評(píng)估方法用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝臟病變進(jìn)展，對(duì)臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估均有重要意義[11]。

基因芯片技術(shù)研究表明HCV不僅可利用宿主細(xì)胞miR干擾靶基因表達(dá)而改變宿主環(huán)境，還可編碼自身miR以促進(jìn)生存和繁殖。同時(shí)，宿主也通過調(diào)節(jié)miR表達(dá)而產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)。miR-122是首個(gè)被證明與HCV復(fù)制緊密相關(guān)的miR，可參與調(diào)節(jié)多種肝臟疾病的發(fā)生和進(jìn)展，現(xiàn)已成為肝臟活動(dòng)性損傷和修復(fù)的重要標(biāo)志物。miR-122對(duì)肝炎病毒復(fù)制和翻譯具有促進(jìn)作用，因此在病毒性肝炎患者血清中水平可出現(xiàn)不同程度增高[12-14]。miR-222與miR-122具有相同種子序列，兩者靶基因約75%一致，故在病毒性肝炎患者中變化趨勢(shì)相似。有研究報(bào)道m(xù)iR-122和miR-222在CHC患者血清中表達(dá)水平均明顯升高且對(duì)評(píng)價(jià)患者肝功能損傷可能具有較大的價(jià)值[5]。本研究顯示，CHC患者血清miR-122和miR-222水平均高于健康人群，提示miR-122、miR-222與HCV感染關(guān)系密切。CHC患者血清miR-122和miR-222水平隨肝炎活動(dòng)度分級(jí)增加而升高。Spearman秩相關(guān)分析顯示，miR-122與患者GGT水平和肝炎活動(dòng)度分級(jí)呈正相關(guān)，miR-222與ALT和肝炎活動(dòng)度分級(jí)呈正相關(guān)，這表明監(jiān)測(cè)miR-122、miR-222水平變化可反映肝組織炎癥水平，為CHC診斷和病情評(píng)估提供參考依據(jù)。

CHC隨病情進(jìn)展常導(dǎo)致肝組織損傷、壞死和纖維化。miR-122主要在肝臟組織中表達(dá)，肝纖維化早期表達(dá)水平較高，當(dāng)肝臟損傷和纖維化加重時(shí)，其表達(dá)水平常出現(xiàn)明顯下調(diào)，是肝纖維化評(píng)價(jià)常用的標(biāo)志物[15]。PIROLA等[16]對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，miR-122水平隨著肝纖維分期升高而降低。本研究顯示，隨著肝纖維化分期升高，CHC患者血清miR-122水平降低，兩者呈負(fù)相關(guān)，與APPOURCHAUX等[6]研究結(jié)果一致，其原因主要為晚期肝纖維化患者正常肝細(xì)胞數(shù)目大幅度減少導(dǎo)致miR-122水平下降。HSC因炎癥或機(jī)械損傷激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的主要病理和生理過程。miR-222在HSC細(xì)胞中表達(dá)水平明顯上調(diào)，可能參與肝纖維化過程的調(diào)節(jié)，同時(shí)有研究認(rèn)為與肝纖維化早期比較，晚期乙肝患者肝組織miR-222表達(dá)水平明顯升高[17-19]。本研究顯示，CHC患者血清miR-222水平隨肝纖維化分期升高明顯增加，兩者呈正相關(guān)，可見肝纖維化患者miR-122和miR-222表達(dá)水平變化趨勢(shì)相反。其原因?yàn)閙iR-122主要由肝細(xì)胞釋放，故在病毒性肝炎等疾病導(dǎo)致肝細(xì)胞活動(dòng)增強(qiáng)時(shí)表達(dá)增加，在肝細(xì)胞數(shù)量減少的肝纖維化等病變中表達(dá)減少。miR-222在HSC細(xì)胞中表達(dá)，在肝組織炎癥和纖維化時(shí)表達(dá)水平均明顯增加。因此，聯(lián)合檢測(cè)miR-122和miR-222可用于判斷肝臟病變的類型及其嚴(yán)重程度，而且有助于減少對(duì)穿刺活檢的依賴，可以為CHC患者病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷提供參考。

4 結(jié) 論

CHC患者血清miR-122和miR-222水平均明顯升高。其中miR-122水平隨肝纖維化分期增加而下降；miR-222表達(dá)水平則隨肝纖維化分期增加而升高。檢測(cè)血清miR-122和miR-222表達(dá)水平，可為CHC病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估提供客觀參考依據(jù)，但若要進(jìn)入臨床應(yīng)用尚需更多研究定量分析其預(yù)測(cè)價(jià)值。