張營(yíng)霞 王京龍 馬 晶 卓麗玲 康美玲 田忠景 丁誠(chéng)實(shí)*

（1 棗莊學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院 山東棗莊277160 2 棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 山東棗莊277160）

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge），薔薇科山楂屬，又名山里紅，山里果、酸棗、山里紅果、酸里紅、紅果。在我國(guó)山東、河南、安徽、山西、江蘇、浙江、吉林、陜西等多個(gè)省份均有分布。核果類水果，果肉薄，核質(zhì)硬，味微酸澀。果可生吃或制作成糕點(diǎn)，亦可入藥，具有降血壓、降血脂、強(qiáng)心、抗心律不齊等作用，同時(shí)也是健脾開(kāi)胃、消食化滯、活血化痰的良藥[1-3]。到目前為止，在山楂中發(fā)現(xiàn)并分離得到的物質(zhì)主要有黃酮類、纖維素、鞣制、黃烷及其聚合物類、有機(jī)酸類、甾體和三萜等，其中以黃酮類為其主要活性成分[4-6]。

最新研究表明，DNA 損傷（斷裂或突變）能夠使細(xì)胞包括干細(xì)胞發(fā)生染色體重排，從而永久性地改變它們的DNA 序列，導(dǎo)致永久性的遺傳損傷，其結(jié)果為細(xì)胞死亡或癌變，而酒精是誘發(fā)細(xì)胞DNA 發(fā)生損傷的重要因素[7-8]。肝細(xì)胞是易受酒精損傷的細(xì)胞，酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是由于長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的肝細(xì)胞受損疾病，是導(dǎo)致肝硬化的最主要病因，也是十大常見(jiàn)死因之一[9]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)酒精性肝病的研究越來(lái)越深入，已發(fā)現(xiàn)中草藥活性成分黃酮具有較強(qiáng)的抗菌、消炎、抗腫瘤等多種藥理作用，能保護(hù)肝細(xì)胞，減輕肝細(xì)胞的損傷，提高肝細(xì)胞的活性功能，而黃酮對(duì)酒精誘發(fā)細(xì)胞DNA 損傷的影響及其機(jī)制研究較少[10-12]。

本文采用不同濃度的山楂黃酮作用乙醇損傷的BRL-3A 肝細(xì)胞，MTT 法檢測(cè)山楂黃酮對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞存活的影響；單細(xì)胞凝膠電泳分析細(xì)胞DNA 的損傷程度并計(jì)算尾距；試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等生理生化指標(biāo)；實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)基因SOD 的表達(dá)變化。本研究為山楂黃酮的醫(yī)藥學(xué)應(yīng)用和肝病防治提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠肝細(xì)胞BRL-3A，揚(yáng)州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院惠贈(zèng)。

主要試劑：山楂黃酮（自提并純化，純度>95%）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清，美國(guó)Gibco 公司；胰蛋白酶，美國(guó)Hyclone 公司；PBS，碧云天生物科技；DMSO，北京索萊寶科技；噻唑藍(lán)，Amresco公司；SOD、MDA、GSH-Px 檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程；RevertAid First strain cDNA Synthesis kit （#K1622），美國(guó)Fermantas 公司；SYBR Green I，美國(guó)Applied Biosystems 公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔板，美國(guó)Corning 公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；3-30K高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；LC 480II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)，瑞士Roche 公司；371 型CO2培養(yǎng)箱、NanoDrop One 微量核酸蛋白定量?jī)x、Multiskan Go 智能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山楂黃酮對(duì)BRL-3A 細(xì)胞存活率的影響取凍存的BRL-3A 肝細(xì)胞迅速放入37 ℃水浴中解凍，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，以含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后，用含血清的DMEM 培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/mL，作為單細(xì)胞懸液，備用。取制備好的單細(xì)胞懸液，接種到96 孔板，貼壁培養(yǎng)24 h 后，每孔加入不同濃度的山楂黃酮儲(chǔ)液，使其終質(zhì)量濃度分別為0.1，1，10 和100 mg/mL，并設(shè)不添加山楂黃酮的空白對(duì)照組，以及只添加DMEM培養(yǎng)液（不含細(xì)胞）的調(diào)零孔。每組設(shè)6 個(gè)重復(fù)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，后用MTT 法檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)490 nm 處的吸光值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率計(jì)算方法如下：細(xì)胞存活率=（A處理組/A對(duì)照組）×100%[13-15]。

1.3.2 乙醇對(duì)BRL-3A 細(xì)胞存活率的影響 取步驟1.3.1 節(jié)中制備好的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，每孔加入不同濃度的乙醇儲(chǔ)液，使其終濃度分別為25，50，75 和100 mmol/L，并設(shè)不添加乙醇的空白對(duì)照組，以及只添加DMEM 培養(yǎng)液（不含細(xì)胞）的調(diào)零孔。每組設(shè)6 個(gè)重復(fù)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，后用MTT 法檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)490 nm 處的吸光值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞存活率，選擇細(xì)胞存活率約為50%的乙醇濃度作為試驗(yàn)濃度。

1.3.3 山楂黃酮對(duì)乙醇損傷BRL-3A 細(xì)胞存活率的影響 取備用的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，貼壁培養(yǎng)24 h 后，各試驗(yàn)組分別加入不同濃度的山楂總黃酮儲(chǔ)液，使其終質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8 和1.0 mg/mL，培養(yǎng)24 h 后，再加入終濃度為100 mmol/L 的乙醇，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，探討山楂黃酮對(duì)乙醇損傷BRL-3A 細(xì)胞增殖的影響。同時(shí)設(shè)置損傷模型對(duì)照組（只添加乙醇）和正常組（不添加乙醇和山楂黃酮）。

1.3.4 山楂黃酮對(duì)乙醇損傷BRL-3A 細(xì)胞SOD活性、MDA 含量和GSH-Px 活性的影響 試驗(yàn)方法同1.3.3 節(jié)，培養(yǎng)結(jié)束后，取細(xì)胞裂解，試劑盒檢測(cè)SOD 活性、MDA 含量和GSH-Px 活性。

1.3.5 單細(xì)胞凝膠電泳 試驗(yàn)方法同1.3.3 節(jié)，收集細(xì)胞。100 μL 1% 正常熔點(diǎn)瓊脂糖（normal melting poin agarose，NMA）鋪在磨砂載玻片上，用蓋玻片將膠壓平，避免氣泡形成，瓊脂糖在低溫下凝固，然后移去蓋玻片。將10 μL 細(xì)胞（1×105/mL）與90 μL 1%低熔點(diǎn)瓊脂糖混勻。將混合物鋪在NMA 上，蓋上蓋玻片，避免氣泡的產(chǎn)生，同樣低溫下使其固化，然后移去蓋玻片。將鋪好膠的磨砂載玻片放在預(yù)冷的裂解液中，4 ℃避光裂解2 h。將裂解后的載玻片從裂解液中取出，用預(yù)冷的去離子水泡3 次，每次5 min。電泳電壓為25 V，電流為300 mA，時(shí)間為30 min。電泳結(jié)束，從電泳槽中取出載玻片，用預(yù)冷的中和液泡3 次，每次5 min。0.5 mg/L 碘化丙啶染色后，用熒光顯微鏡觀察DNA，并利用圖像彗星試驗(yàn)軟件工程分析軟件（CASP 1.2.3，Wroclaw，Poland）[16-18]。

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測(cè)基因表達(dá) 試驗(yàn)方法同1.3.3 節(jié)，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞。提取總RNA，未山楂黃酮處理組作為對(duì)照。微量核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)RNA 的純化與含量，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。SYBR Green I qPCR 絕對(duì)定量檢測(cè)SOD 基因，β-actin 作為內(nèi)參基因。SOD 基因的引物為AAGGCCTGCATGGATTCCA和TTGGCCCACCGTGTTTTCT，β-actin 基因的引物為GCTCGTCGTCGACAACGGCTC 和CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行成組數(shù)據(jù)T 檢驗(yàn)，P＜0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂黃酮對(duì)BRL-3A 細(xì)胞增殖的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，山楂黃酮質(zhì)量濃度在0～1 mg/mL 范圍內(nèi)對(duì)肝細(xì)胞活性沒(méi)有顯著影響（P＞0.05），當(dāng)山楂黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL 及以上時(shí)，細(xì)胞活性明顯下降，呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。故本研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中山楂黃酮的質(zhì)量濃度設(shè)定在0～1 mg/mL 范圍內(nèi)（圖1）。

2.2 乙醇對(duì)BRL-3A 細(xì)胞增殖的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著乙醇濃度的增加，各處理組的細(xì)胞存活率均與對(duì)照組存在顯著性差異（P＜0.05）。當(dāng)乙醇濃度為100 mmol/L 時(shí)，肝細(xì)胞存活率為47.3%，符合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，因此，本研究后續(xù)的試驗(yàn)中采用該濃度作為試驗(yàn)濃度（圖2）。

2.3 山楂黃酮對(duì)乙醇損傷BRL-3A 細(xì)胞存活率的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，乙醇模型組的細(xì)胞存活率極顯著降低，肝細(xì)胞損傷模型造模成功。與模型組相比，0.2 mg/mL 山楂黃酮能夠顯著提高損傷肝細(xì)胞的存活率，0.4 mg/mL 和0.8 mg/mL 山楂黃酮能夠極顯著提高損傷肝細(xì)胞的存活率（圖3）。

2.4 山楂黃酮對(duì)肝細(xì)胞DNA 損傷的影響

熒光顯微鏡下，DNA 被碘化丙啶染成橙紅色，正常細(xì)胞的DNA 呈圓形亮斑，電泳后無(wú)拖尾現(xiàn)象 （圖4a）。乙醇損傷細(xì)胞的DNA 呈彗星狀，DNA 損傷越大，彗星的尾巴就會(huì)越長(zhǎng)（圖4b）。0.2，0.4 和0.8 mg/mL 山楂黃酮能夠改善乙醇對(duì)肝細(xì)胞DNA 的損傷，彗星的尾巴變短，且山楂黃酮濃度越大，改善作用越明顯（圖4c、4d、4e）。

計(jì)算細(xì)胞的Olive 尾距，隨著山楂黃酮濃度的增大，乙醇損傷肝細(xì)胞的尾距呈下降趨勢(shì)。當(dāng)山楂黃酮濃度達(dá)到0.8 mg/mL，損傷細(xì)胞的尾距下降到15±3.1（μm）。進(jìn)一步說(shuō)明山楂黃酮對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞的修復(fù)作用，且該作用具備量效關(guān)系（圖5）。

圖1 山楂黃酮對(duì)BRL-3A 細(xì)胞存活率的影響（x±s，n=6）Fig.1 Effects of different concentrations of hawthorn flavonoids on the survival rates of BRL-3A cells

圖2 乙醇對(duì)BRL-3A 細(xì)胞存活率的影響（x±s，n=6）Fig.2 Effects of ethanol on the survival rates of BRL-3A cells

圖3 不同濃度山楂黃酮對(duì)乙醇損傷BRL-3A 細(xì)胞存活率的影響（x±s，n=6）Fig.3 Effects of different concentrations of hawthorn flavonoids on the survival rates of ethanol-injuried BRL-3A cells

圖4 山楂黃酮對(duì)乙醇誘導(dǎo)BRL-3A 細(xì)胞DNA 損傷的影響Fig.4 Effects of different concentrations of hawthorn flavonoids on the DNA damage of ethanol-injuried BRL-3A cells

圖5 山楂黃酮對(duì)乙醇誘導(dǎo)BRL-3A 細(xì)胞Olive尾距的影響Fig.5 Effects of different concentrations of hawthorn flavonoids on the Olive tail moment of ethanol-injuried BRL-3A cells

2.5 山楂黃酮對(duì)乙醇損傷BRL-3A 肝細(xì)胞SOD活性、MDA 含量和GSH-Px 活性的影響

與正常對(duì)照組相比，乙醇能夠顯著降低BRL-3A 肝細(xì)胞內(nèi)的SOD 和GSH-Px 活性，提高了脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA 的含量。與乙醇損傷組相比，0.2，0.4 和0.8 mg/mL 山楂黃酮均能夠顯著改善損傷細(xì)胞的抗氧化指標(biāo)，0.2 mg/mL 山楂黃酮能夠顯著提高肝細(xì)胞內(nèi)的SOD 和GSH-Px 活性、降低MDA的含量，0.4，0.8 mg/mL 山楂黃酮能夠極顯著提高SOD 和GSH-Px 活性、降低MDA 含量。

2.6 山楂黃酮對(duì)乙醇損傷BRL-3A 細(xì)胞SOD基因mRNA 表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，100 mmol/L 乙醇能夠極顯著地降低細(xì)胞內(nèi)SOD 基因的mRNA 表達(dá)。與乙醇損傷組相比，0.2，0.4 和0.8 mg/mL 山楂黃酮均能夠顯著上調(diào)肝細(xì)胞SOD 基因的表達(dá)，且具有量效依賴關(guān)系（圖6）。

3 討論

DNA 損傷在腫瘤、衰老、炎癥、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等病理生理過(guò)程中起著重要作用。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和糖基化等細(xì)胞過(guò)程誘導(dǎo)形成高活性的內(nèi)源性醛，與DNA 直接反應(yīng)，形成醛衍生的DNA 加合物，導(dǎo)致DNA 損傷。在持續(xù)的條件影響下，醛衍生的DNA 加合物誘發(fā)的未修復(fù)的DNA 損傷引起細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失控，從而易于疾病表型的形成和積累。一些高活性醛如4-羥基壬烯醛、丙二醛、丙烯醛、巴豆醛和甲基乙二醛水平升高，與細(xì)胞死亡、突變、癌變有關(guān)。研究人員給小鼠喂食稀釋的酒精（乙醇），動(dòng)物身體代謝酒精時(shí)產(chǎn)生有害的化學(xué)物乙醛，乙醛能夠讓造血干細(xì)胞中的DNA 遭受斷裂和損傷[7-8]。

表1 不同濃度山楂黃酮對(duì)乙醇損傷BRL-3A 細(xì)胞SOD 活性、MDA 含量和GSH-Px 活性的影響Table 1 Effects of different concentrations of hawthorn flavonoids on SOD activity，MDA content and GSH PX activity of ethanol-injuried BRL-3A cells

圖6 山楂黃酮對(duì)乙醇損傷BRL-3A 細(xì)胞SOD 基因mRNA 表達(dá)的影響Fig.6 Effects of different concentrations of hawthorn flavonoids on the mRNA expression of SOD in ethanol-injuried BRL-3A cells

通過(guò)在培養(yǎng)液中添加乙醇，來(lái)?yè)p傷肝細(xì)胞，制備肝細(xì)胞損傷模型。其損傷機(jī)理是酒精在肝內(nèi)代謝產(chǎn)生毒性物質(zhì)乙醛，同時(shí)產(chǎn)生多種活性氧自由基，這些自由基可攻擊肝細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，造成肝細(xì)胞的廣泛損傷，使乙醇表現(xiàn)為肝毒性[19-20]。本研究中，100 mg/mL 的乙醇抑制了肝細(xì)胞BRL-3A 的存活率，損傷了細(xì)胞的DNA，使得細(xì)胞內(nèi)的SOD 活性、GSH-Px 活性顯著降低，MDA含量升高，不同濃度的山楂黃酮能夠緩解這種抑制和損傷作用。研究中發(fā)現(xiàn)，山楂黃酮能夠通過(guò)抗氧化改善這種乙醇引起的DNA 損傷，這種改善作用與SOD 基因的上調(diào)表達(dá)密切相關(guān)。

黃酮作為山楂中的有效成分，提取得率可達(dá)5.4%[21-22]。小鼠酒精肝損傷體內(nèi)試驗(yàn)中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)山楂黃酮能夠減輕酒精對(duì)肝臟的損傷，降低TNF-α 水平，減少細(xì)胞凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)體外試驗(yàn)中，山楂黃酮具有修復(fù)乙醇誘發(fā)的DNA 損傷作用。隨著山楂黃酮對(duì)肝損傷治療的深入研究，山楂的綜合開(kāi)發(fā)利用將得到進(jìn)一步發(fā)展。