艾楊洋 丁國芳，2* 楊最素 余方苗 唐云平 陳 艷 黃芳芳

（1 浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院/浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術研究中心 浙江舟山316022 2 浙江省海洋水產研究所 浙江舟山316021）

長鰭金槍魚（T.alalunga），別名長鰭鮪，屬脊索動物門（Chordata），輻鰭魚亞綱（Actinopterygii），鱸形目（Perciformes），鯖科（Scombridae），金槍魚屬（Thunnus）[1]。長鰭金槍魚為大洋中上層洄游性魚類，廣泛分布于全世界溫帶及熱帶海域，我國沿海亦有少量分布。其營養(yǎng)價值較高，魚肉中粗蛋白含量達到90%以上[2]。隨著遠洋漁業(yè)的快速發(fā)展，金槍魚年產量達到約600 萬t，其中長鰭金槍魚的年產量約占全球金槍魚產量的7%。金槍魚魚肉一般加工成罐頭、魚松等產品，而魚頭、魚皮、魚骨等廢棄物在總質量中占50%～70%[3]。這些廢棄物常被加工成魚粉等作為飼料或肥料處理，其附加值較低。將廢棄物作為海洋功能食品的開發(fā)，對于海洋資源的再利用及環(huán)境保護具有重要意義。本研究以長鰭金槍魚廢棄物作為原料，通過酶解法提取活性多肽，作用于經H2O2誘導的張氏肝細胞（Chang liver），以相對增殖率 （relative growth rate，RGR）及肝損傷的檢測指標等為依據，探討該多肽是否對損傷的張氏肝細胞具有保護作用，為長鰭金槍魚多肽（T.alalunga polypeptide，TAP）的研發(fā)提供試驗依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

長鰭金槍魚廢棄物，寧波今日食品有限公司；張氏肝細胞，中南大學湘雅醫(yī)學院細胞庫；H2O2，DMSO，國藥集團化學試劑有限公司；異丙醇，上海生物工程有限公司；NaHCO3，上海虹光化工廠；DMEM，Gibco 公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品有限公司；MTT，Sigma 公司；胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶，亞太恒信生物科技有限公司；青霉素、鏈霉素，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；AnnexinV-FITC/PI 雙染試劑盒，凱基生物工程有限公司；所用試劑盒包括丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、乙醇脫氫酶（ADH），南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

PHS-250 pH 計，上海理達儀器廠；Spectra-Max M2 多功能酶標儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；Forma3111 CO2細胞培養(yǎng)箱，杭州寶城生物科技有限公司；CF16RXП日立低溫離心機，日本日立公司；ALPHA 1-4/LD plus 冷凍干燥機，德國Christ ALPHA 公司；超凈臺ZHJM-C12090，上海智城分析儀器制造有限公司。

2 方法

2.1 長鰭金槍魚多肽的制備

2.1.1 金槍魚廢棄物預處理 將金槍魚廢棄物常溫解凍，沖洗，瀝干，放入絞碎機中攪碎直至糊狀，在50 ℃下用異丙醇脫脂6 h，清洗。

2.1.2 張氏肝細胞損傷模型的制備 通過MTT法檢測H2O2在300～1 000 μmol/L 不同濃度梯度下對張氏肝細胞的損傷情況，以細胞的存活率為80%左右為標準，確定H2O2的最佳濃度。

2.1.3 MTT 法測細胞相對增殖率 將張氏肝細胞以細胞密度1×105個/mL 接種至96 孔板中，設加藥組、模型組、正常組和空白對照組。經24 h 貼壁后，加藥組加入質量濃度為0.25 mg/mL 的樣品。培養(yǎng)12 h 后，加藥組和模型組加入終濃度為600 μmol/L 的H2O2損傷。作用4 h 后棄液，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)箱中取出，加入150μL DMSO溶解，振蕩10 min 后，放置于多功能酶標儀490nm 處測定吸光度[4]。

（Relative Growth Rate，RGR）%=（A1-A2）/A2×100

式中：A1——加藥組吸光度；A2——模型組吸光度。

2.1.4 最佳酶種選擇 各取5 g 預處理后的樣品，參照文獻[5]中堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的最適酶解溫度及pH 值，在固定條件下取加酶量1 000 U/g，酶解時間4 h，料液比1∶5（g/mL）為酶解條件。酶解完畢后滅活15 min，離心機12 000 r/min 下離心15 min，取上清液，MTT 法測其對H2O2誘導的張氏肝細胞細胞損傷的相對增殖率，從而獲得最佳酶種。

表1 不同酶的最適酶解溫度和pH 值Table 1 The optimum temperature and pH of the different enzymes

2.1.5 酶解條件優(yōu)化 在確定了最佳的蛋白酶種之后，設計5 因素4 水平的正交試驗表，正交試驗設計見表2。同樣采用MTT 法，以細胞的相對增殖率為指標，確定最佳酶解條件。

表2 單因素試驗因素與水平表Table 2 Level of orthogonal experimental factors

2.1.6 長鰭金槍魚多肽的分離 純化最佳酶解條件下所得到的酶解產物進行超濾，取最優(yōu)分子段產物用陰離子交換色譜、凝膠過濾色譜、反相高效液相色譜分析，得到最佳組分進行氨基酸序列分析及質譜檢測。

2.2 細胞形態(tài)觀察及肝細胞生化指標檢測

取對數(shù)生長期的張氏肝細胞制成懸液，均勻接種至6 孔板，設低劑量組（0.1 mg/mL），高劑量組（0.4 mg/mL），模型組，正常組，培養(yǎng)12 h，再經600 μmol/L 的H2O2損傷4 h 后，在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)拍照后，測定張氏肝細胞內AST、ALT、MDA、ADH 和SOD 的含量。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

試驗的分組與H2O2損傷同2.1.3 節(jié)，按照Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒說明書操作，使用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

2.4 數(shù)據處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據，所有統(tǒng)計數(shù)據以±SD表示，組間差異采用one-way ANOVA 分析，以P＜0.05 為差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 金槍魚多肽的制備

3.1.1 張氏肝細胞損傷模型的制備 不同濃度的H2O2誘導張氏肝細胞損傷的結果見圖1，從圖中可以看出，為了使細胞損傷達到一定效果，又不使其過度損傷，故選擇600 μmol/L 的H2O2作為損傷濃度。

3.1.2 最佳酶種的篩選 5 種蛋白酶酶解長鰭金槍魚廢棄物的結果如圖2所示，胰蛋白酶酶解液對相對增值率最大，可達49.5%，因此選用胰蛋白酶進行酶解。

圖1 不同濃度H2O2 對于張氏肝細胞活性的影響Fig.1 Influence of different concentrations of H2O2 on cell activity of Chang liver

圖2 不同酶解液對H2O2 誘導的細胞相對增殖率影響Fig.2 The relative multiplication rate of H2O2 induced by different enzyme solution

3.1.3 酶解條件優(yōu)化的正交試驗設計結果 正交試驗如表3所示，利用極差法分析得到不同酶解條件下影響相對增殖率的各因素主次關系為：A＞D＞B＞C＞E。故對于相對增殖率影響最大的為A（料液比）。通過比較每個水平對H2O2誘導的張氏肝細胞細胞相對增殖率的影響，本研究篩選出最佳的酶解條件為：A2B3C2D2E3，即料液比1 ∶3，酶解pH 9.0，加酶量900 U/g，酶解溫度45 ℃，酶解時間5 h。在此最佳酶解條件下，經3 次重復試驗驗證，細胞的相對增殖率達到（63.1 ± 3.42）%。

3.1.4 酶解液超濾結果 酶解液經超濾截留試驗如圖4所示，TAP-1 的組分相對增殖率最高，達到88.6%。因此，選擇TAP-1 的組分進行下一步純化分離。

3.1.5 DEAE-Sepharose FF 離子交換層析分離結果 組分TAP-1 經DEAE-Sepharose FF 離子交換層析分離，從圖4（a）中可知，分出4 個組分，分別是TAP-1-1，TAP-1-2，TAP-1-3 和TAP-1-4。從圖4（b）中可知，TAP-1-1 組分對H2O2誘導的細胞相對增殖率最高，達到96.3%。因此，選擇TAP-1-1 進行下一步純化分離。

表3 L16（45）正交試驗設計及結果Table 3 The design and results of L16（45）orthogonal experiment

圖3 不同分子質量的TAP 對相對增殖率的影響Fig.3 Effects of albacore tuna polypeptides on the relative multiplication rate of different molecular weight

3.1.6 Sephadex G25 凝膠柱分離結果 組分TAP-1-1 經Sephadex G25 凝膠柱分離后，由圖5（a）可知，分出3 個組分，分別為TAP-1-1-1，TAP-1-1-2 和TAP-1-1-3。由圖5（b）可知，TAP-1-1-2 組分對H2O2誘導的細胞相對增殖率最高，達到68.2%。因此，選擇TAP-1-1-2 組分進行下一步純化分離。

3.1.7 反相高效液相色譜檢測及多肽質譜結果TAP-1-1-2 組分經反相高效液相色譜純化如圖6（a）所示，8.177 min 出現(xiàn)單一峰。此峰為TAP-1-1-1 的主要物質，其對H2O2誘導的細胞相對增殖率為68.7%，具有較好的活性。其氨基酸序列為Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Cys-Phe-Lys。經質譜鑒定，從圖6（b）中可看出，其分子質量為1 236.42 ku，與氨基酸測序獲得的多肽的分子質量一致。

圖4 陰離子DEAE-Sepharose FF 洗脫峰及陰離子分離組分對相對增殖率的影響Fig.4 Elution peaks on DEAE Sepharose Fast Flow and effects of different fractions from DEAE Sepharose Fast Flow on relative multiplication rate

圖5 Sephadex G25 凝膠柱洗脫峰及Sephadex G25 凝膠柱分離組分對相對增殖率的影響Fig.5 Elution peaks on Sephadex G-25 and effects of different fractions from Sephadex G-25 on relative multiplication rate

圖6 經反向高效液相色譜純化后洗脫峰及質譜圖Fig.6 RP-HPLC elution peaks and spectrum of TAP

3.2 長鰭金槍魚多肽對H2O2 誘導的張氏肝細胞損傷的保護作用

3.2.1 肝細胞生化指標檢測結果如表4所示，與正常組相比，模型組中ALT，AST，ADH 和MDA 活性顯著升高，這說明張氏肝細胞經H2O2誘導，具有明顯的損傷。而經長鰭金槍魚多肽各劑量組作用之后，ALT，AST，ADH 和MDA 的活性降低，SOD的含量增加，且高劑量組均具有統(tǒng)計學意義。

表4 肝細胞生化指標檢測結果（x±SD，n=6）Table 4 Determination results of liver cell function index （x±SD，n=6）

3.2.2 細胞形態(tài)觀察結果 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)如圖7所示，圖A 正常組的張氏肝細胞長勢良好，細胞形態(tài)飽滿，呈上皮樣。經H2O2誘導4 h 后，圖B 模型組中細胞形態(tài)不規(guī)則，有大片細胞漂??；圖C 低劑量組中有部分細胞形態(tài)不規(guī)則，貼壁細胞變圓，皺縮，脫落；低劑量組與高劑量組TAP 中雖有部分細胞形態(tài)不規(guī)則，但與模型組有明顯區(qū)別，進一步說明TAP 對于H2O2誘導的張氏肝細胞有保護作用。

3.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果 流式細胞儀檢測細胞凋亡的結果如圖8所示，左下象限顯示正常細胞，顯示為（FITC-/PI-）；右下象限為早期凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）；右上象限為凋亡晚期或是死細胞，為（FITC+/PI+）。與正常組相比，其它各組晚期凋亡細胞明顯增多，正常細胞明顯減少。與模型組相比，低劑量組與高劑量組晚期凋亡細胞減少，其中高劑量組晚期凋亡細胞減少明顯。

圖7 倒置顯微鏡下的張氏肝細胞（×200）Fig.7 Morphological changes of Chang liver cells under an inverted microscope （×200）

圖8 流式細胞儀檢測TAP 對H2O2 誘導的張氏肝細胞的影響Fig.8 The effect of TAP on Chang liver cells induced by H2O2 was detected by flow cytometry

4 討論與結論

肝臟作為人體內最大的解毒器官，對來自體內外的有毒物質通過一定的生物轉化方式將其分解或以原形排出體外。在這個過程中，肝臟容易受到損害，引起肝臟的炎癥、腫大、壞死、纖維化甚至導致肝硬化，從而失去治愈的機會。我國是肝病大國，每年因肝病死亡人數(shù)達到35 萬人以上。因此，對于肝病的防護成為人們不可忽視的話題[6]。盡管治療肝病的藥物眾多，但這些化學合成藥物的長期應用加重肝代謝的負擔，甚至引起原有肝病的惡化。海洋作為生命的起源地，蘊藏著大量的天然藥物，從海洋生物中提取高效、低毒的保肝活性物質成為當今研究的熱點[7]。而海洋生物活性多肽更顯示出明顯的優(yōu)勢而倍受關注。海洋生物活性多肽的提取方法有直接提取法、酶水解法和化學合成法等。其中酶水解法具有反應條件溫和、設備要求低、易操作、轉化率高等優(yōu)點[8]。因此本試驗利用長鰭金槍魚加工過程的廢棄物，運用酶解提取分離技術獲得活性多肽，以H2O2誘導張氏肝細胞的相對增殖率為指標，在5 種常見酶中選出胰蛋白酶為本試驗用酶，單正交試驗優(yōu)化酶解條件，再經純化分離，得到長鰭金槍魚多肽的關鍵技術為：料液比1∶3，pH 9，加酶量900 U/g，溫度45 ℃，時間5 h，其N 端氨基酸序列為Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Cys-Phe-Lys。這對于開發(fā)海洋護肝功能食品具有較好的應用前景。

肝細胞是肝臟中最主要的細胞，肝細胞損傷是肝病的共同病理基礎，是不同肝病的共同表現(xiàn)[9]。因此建立肝細胞損傷模型對于研究肝病的發(fā)生、防治可避免動物模型的周期較長、試驗條件易變等不利因素而被廣大學者所采用，張氏肝細胞是肝細胞損傷的首選細胞。而H2O2作為誘導源具有易溶于水、價格便宜、損傷能力強、性質相對穩(wěn)定的特點，是建立細胞氧化損傷的理想誘導劑[10]。試驗發(fā)現(xiàn)600 μmol/L 的H2O2損傷4 h 后可引起張氏肝細胞的損傷，這與黃麗等[11]研究的肝細胞損傷模型相似。因此，通過肝細胞生化指標的檢測，可反映肝細胞功能的變化。當肝細胞受到一定程度的損傷時，細胞膜通透性增加，ALT、AST 從線粒體和胞漿中釋出。ALT、AST 活性越高，說明細胞受損越嚴重[12]。MDA 與SOD 的含量可以反映肝細胞對于氧自由基的清除能力與肝細胞受自由基損傷的嚴重程度[13]。ADH 活性的增高能間接說明ALT 活性的增高只是由于肝細胞受損而引起的。試驗結果表明，肝細胞的損傷程度減輕，TAP 對于酶活性的維持起到了保護作用。

倒置顯微鏡下觀察肝細胞的形態(tài)學變化能較直接地反映其結構的改變，試驗表明，經H2O2誘導的張氏肝細胞損傷明顯，大片細胞懸??；而經TAP 作用后，細胞形態(tài)較模型組有較大改善。當細胞受到損傷后除形態(tài)學改變外，還會引進細胞膜內表面上的磷脂酰絲氨酸外翻而表現(xiàn)出凋亡，細胞凋亡是機體生長發(fā)育和病理狀態(tài)中細胞死亡的過程[14]。借助于外翻的磷脂酰絲氨酸能與Annexin V 高度親和結合的原理，通過流式細胞儀能進行檢測。將Annexin V 標以熒光素FITC，再結合核酸染料PI，就能把正常細胞，處于不同凋亡時期的細胞和壞死細胞加以區(qū)分開來。本試驗利用Annexin V FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒，經流式細胞儀檢測后顯示，與模型組相比，低劑量組晚期細胞平均凋亡率減少6.6%，高劑量組晚期細胞平均凋亡率減少18.7%，進一步說明TAP 對于細胞凋亡具有一定的抑制作用。

綜上，在高劑量（0.4 mg/mL）的TAP 作用下，經H2O2誘導的張氏肝細胞受到了較好的保護作用。但TAP 如何保護經H2O2誘導的張氏肝細胞的相關機制還需進一步研究。