蔡路昀 史 航 曹愛玲 周小敏 張宇昊 趙元暉 勵(lì)建榮*

（1 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州121013 2 杭州海關(guān) 杭州311208 3 浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司 浙江舟山316101 4 西南大學(xué)食品學(xué)院 重慶400715 5 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島266100）

膠原蛋白（collagen）在動(dòng)物體內(nèi)含量多、分布廣，約占哺乳動(dòng)物總蛋白的25%～30%，構(gòu)成了全身大部分的結(jié)締組織，肌腱、眼球、血管、骨骼也含有大量的膠原蛋白。膠原蛋白具有低免疫原性、相容性、可降解性、凝血性等生物特性，其優(yōu)良的性質(zhì)已被應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)材料、組織工程、燒傷、美容、食品等領(lǐng)域并占有重要地位。目前已發(fā)現(xiàn)28種膠原蛋白，最為常見的是纖維狀的Ⅰ型膠原蛋白[1]。研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)膠原蛋白含量高于陸生動(dòng)物，且種類較少，主要由分布在鱗、鰾、肌肉、皮、骨等處的Ⅰ型、脊索和軟骨的Ⅱ型、Ⅺ型以及肌肉的V 型組成，其中Ⅰ型膠原蛋白富含丙氨酸和糖結(jié)合型的羥賴氨酸[2]。

鰈魚（Pleuronichthys coconuts）又稱比目魚，是溫帶海域重要的經(jīng)濟(jì)魚類。鰈魚含有豐富的多不飽和脂肪酸，易被人體吸收，有助于降低血液中膽固醇濃度[3]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鰈魚的研究主要側(cè)重于養(yǎng)殖育種方面。隨著養(yǎng)殖技術(shù)的提高，鰈魚產(chǎn)量穩(wěn)步上升。然而目前我國(guó)海水魚加工科技含量低，加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料如魚皮、魚骨等，尤其是鰈魚魚骨，其質(zhì)量約占整魚的40%，這些下腳料常常被丟棄或以低價(jià)賣給魚粉廠，簡(jiǎn)單做成魚粉和肥料等低附加值產(chǎn)品，資源和副產(chǎn)物的利用程度低，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約著海水漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

本文以鰈魚加工副產(chǎn)物魚骨為材料，采用酸法和酶法對(duì)鰈魚骨膠原蛋白進(jìn)行提取純化，對(duì)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)與流變學(xué)特性進(jìn)行分析，以期為鰈魚骨膠原蛋白的開發(fā)利用及工業(yè)化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰈魚魚骨，由大連天寶綠色食品股份有限公司提供；胃蛋白酶（50 萬(wàn)U/g），吉寶（青島）生物科技有限公司；丙烯酰胺 （Acr）、四甲基乙二胺（TEMED）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考馬斯亮藍(lán)R-250（優(yōu)級(jí)純）、標(biāo)準(zhǔn)蛋白（分子質(zhì)量6.5～200 ku），上海索萊寶公司；NaOH、異丙醇、冰乙酸、KBr、NaCl、EDTA-2Na，錦州國(guó)藥器化玻有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biofuge stratos 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；DHR-1 流變儀，美國(guó)TA 公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Free Zone 2.5 真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco 公司；UV-2550 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；Scimitar2000 傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Agilent 公司；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司；Mini Protean 3凝膠電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；ZD-9556 脫色搖床，常州市凱航儀器有限公司；GS-800 拍照系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；HTC-100 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海三騰儀器有限公司；DHR-1 流變儀，美國(guó)TA 公司；SZ-1 快速混勻器，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；DSC-Q2000 差示掃描量熱儀，美國(guó)TA 公司。

1.3 鰈魚魚骨預(yù)處理

首先將魚骨用去離子水清洗剔除干凈后放入4 ℃冰箱備用。以下提取純化操作均在4 ℃下進(jìn)行。參考Somasundaram 等[4]方法稍作修改，稱取一定質(zhì)量魚骨并將其均勻剪切至2～3 mm，加入其質(zhì)量20 倍的0.1 mol/L NaOH 溶液以去除雜蛋白，低速攪拌浸泡，每2 h 換一次溶液，6 h 后加入其質(zhì)量30 倍的10%異丙醇溶液以去除脂肪，每12 h 換一次溶液浸泡一天，再加入其質(zhì)量5 倍的0.5 mol/L EDTA-2Na 溶液，每12 h 換一次溶液，更換5 次。魚骨每換一種溶液均用去離子水反復(fù)沖洗至中性，充分瀝干。將魚骨冷凍干燥后密封放入-20 ℃冰箱待用。

1.4 酸法提取

參考Zhang 等[5]方法稍作修改，稱取預(yù)處理后的魚骨，加入其質(zhì)量20 倍的0.5 mol/L 冰乙酸溶液，在4 ℃下低速攪拌12 h 后以10 000 r/min 離心20 min，收集上清液放于4 ℃冰箱。之后將未提取徹底的魚骨進(jìn)行以上相同處理，如此反復(fù)3 次，合并混合上清液得酸法膠原蛋白粗提液。

1.5 酶法提取

參考Chen 等[6]方法稍作修改，稱取預(yù)處理后的魚骨加入其質(zhì)量10 倍的超純水，用0.5 mol/L的冰乙酸將溶液的pH 調(diào)至1.9 左右，加入原魚骨質(zhì)量2%的胃蛋白酶，后續(xù)方法同酸法處理，如此反復(fù)兩次，合并收集上清液得酶法膠原蛋白粗提液。

1.6 膠原蛋白粗提液的純化

參考Somasundaram 等[4]方法稍作修改，酶法膠原蛋白粗提液先用高濃度NaOH 溶液將pH 調(diào)至8.0 以上進(jìn)行滅酶，然后均勻慢速加入NaCl 固體粉末至其濃度達(dá)到0.9 mol/L，使粉末充分溶解并保證無(wú)大塊固體沉積。酸法膠原蛋白粗提液的處理同上，但無(wú)需調(diào)pH。將以上處理好的溶液放置4 ℃冰箱過(guò)夜后，以12 000 r/min 在4 ℃下離心30 min 得鹽析沉淀。分別將兩種沉淀復(fù)溶于0.5 mol/L 冰乙酸中，依次用0.1 mol/L 冰乙酸、超純水進(jìn)行透析直至溶液中無(wú)氯離子檢出，最后將透析過(guò)后的溶液進(jìn)行冷凍干燥即得到樣品酸溶性膠原蛋白（ASC）和酶溶性膠原蛋白（PSC）。

1.7 鰈魚骨膠原蛋白的結(jié)構(gòu)分析

1.7.1 紫外光譜分析 參考Caputo 等[7]方法稍作修改，準(zhǔn)確稱取2 mg 凍干的膠原蛋白樣品，充分溶解于10 mL 的0.5 mol/L 冰乙酸溶液中，以0.5 mol/L 冰乙酸作空白對(duì)照，常溫下用紫外可見分光光度計(jì)在190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)中速掃描，波長(zhǎng)間隔2 nm。

1.7.2 紅外光譜掃描分析 參考Jeong 等[8]方法稍作修改，通過(guò)傅里葉紅外光譜儀對(duì)膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成進(jìn)行分析。分別取凍干的膠原蛋白樣品（1 mg）與干燥的KBr（100 mg）置于瑪瑙研缽中研磨成均勻粉末，裝樣壓片，放入樣品室掃描。波數(shù)范圍4 000～500 cm-1，分辨率為2 cm-1。

1.7.3 SDS-PAGE 分析 參考Lowry 等[9]方法并稍作修改，分別取2 mg ASC 或PSC 凍干樣品溶于10% SDS 中，加熱至85 ℃保持1 h 后，按1 ∶1的比例與上樣緩沖液混合后，沸水浴3～5 min，冷卻后取10 μL 上樣。采用5%的濃縮膠，12%的分離膠制膠。采用直壓恒流電源，濃縮膠80 V，分離膠120 V，結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色40 min，脫色后觀察分析。

1.7.4 DSC 分析 參考溫慧芳等[10]方法稍作修改，利用差式掃描量熱儀測(cè)量鰈魚骨膠原蛋白的熱收縮溫度。稱取7 mg 凍干樣品于DSC 坩堝中，加蓋壓片密封后，以空坩堝作對(duì)照，在20 ℃保持1 min，從20 ℃加熱至80 ℃，升溫速度為5 ℃/min。

1.7.5 SEM 掃描分析 參考Palka 等[11]方法稍作修改，利用掃描電鏡觀察鰈魚骨膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)。取適量?jī)龈傻男螤钜?guī)則的膠原蛋白樣品經(jīng)離子濺射鍍金，在3.0 kV 電壓下放大1 000 倍觀察膠原蛋白的表面結(jié)構(gòu)。

1.8 流變學(xué)分析

取適量?jī)龈傻哪z原蛋白樣品溶解于0.5 mol/L的冰乙酸中并充分混合均勻，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的膠原蛋白溶液。使用40 mm、2°的椎板，在20℃條件下進(jìn)行測(cè)試。在振蕩模式下，采用頻率掃描的數(shù)據(jù)獲取模式，頻率掃描范圍為0.1～10 Hz，變量掃描為對(duì)數(shù)模式，采集33 個(gè)變量點(diǎn)，控制變量為形變率（30%）。研究膠原蛋白溶液的儲(chǔ)能模量（彈性模量）G′、損耗模量（黏性模量）G″隨著振蕩頻率變化的規(guī)律[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜的分析

圖1 鰈魚骨ASC 和PSC 的紫外吸收光譜圖Fig.1 UV spectrum of ASC and PSC from flounder bone

膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)的肽鏈和側(cè)鏈?zhǔn)钱a(chǎn)生紫外吸收的主要原因。如圖1所示，在210 nm 波長(zhǎng)以下產(chǎn)生的吸收峰是由于膠原蛋白分子中存在的肽鍵及相關(guān)構(gòu)象[13]；在226 nm 和227 nm 處分別產(chǎn)生鰈魚骨PSC 和ASC 的最大吸收峰，是由于肽鍵C=O 的n→π* 躍遷所致，符合Ⅰ型膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的紫外吸收特征[14]；而Ⅰ型膠原蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中缺乏如酪氨酸、苯丙氨酸等具有共軛雙鍵的芳香族氨基酸，因此沒(méi)有出現(xiàn)大多數(shù)蛋白質(zhì)在280 nm 處的吸收峰[15]。而這與其它魚膠原蛋白的研究結(jié)果相似[16]。由膠原蛋白的紫外光譜掃描可以看出ASC 與PSC 具有相似的吸收峰，故此推斷鰈魚骨ASC 與PSC 具有一定相似程度的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.2 紅外光譜分析

如圖2和表1所示ASC 和PSC 均具有膠原蛋白紅外光譜特征吸收峰，包括酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及A 和B 帶。ASC 和PSC 的酰胺A 帶的吸收峰波長(zhǎng)均小于3 400 cm-1，是吸收峰由于NH 基團(tuán)與氫鍵締合后發(fā)生了藍(lán)移現(xiàn)象[17]。酰胺B 帶是由于-CH2-產(chǎn)生的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)。

酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶是反映蛋白質(zhì)肽鏈骨架結(jié)構(gòu)最重要的吸收峰，與膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)有關(guān)[18]。酰胺Ⅰ帶為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的敏銳區(qū)域，酰胺Ⅱ帶為α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的扭轉(zhuǎn)振動(dòng)峰；酰胺Ⅰ和Ⅱ反映了肽鏈之間的交聯(lián)程度，肽鏈結(jié)合越緊密振動(dòng)頻率越大，由圖2顯示PSC 的3 條α 肽鏈比ASC 結(jié)合緊密[19]。酰胺Ⅲ帶反應(yīng)了膠原蛋白是否保持了完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，是甘氨酸和脯氨酸殘基的-CH2-特征振動(dòng)峰[20]，由此可以說(shuō)明ASC 和PSC 均具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

2.3 SDS-PAGE 分析

由圖3電泳圖譜可以看出，膠原蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大，1 個(gè)膠原分子相對(duì)分子質(zhì)量為300 ku，即膠原的每條多肽鏈相對(duì)分子質(zhì)量可達(dá)100 ku[21]。在高于200 ku 處ASC 出現(xiàn)的可能是Ⅰ型膠原蛋白α 鏈的三聚體γ 鏈，在200 ku 附近均出現(xiàn)的1 條泳帶是β 鏈，在100 ku 附近ASC 與PSC 分別出現(xiàn)的2 條泳帶分別是α1 鏈和α2 鏈，表明ASC 與PSC 主要含有Ⅰ型膠原蛋白，并且具有較完整的三螺旋結(jié)構(gòu)[22]。相對(duì)于PSC 來(lái)說(shuō)ASC 在66.4 ku 以下的部分出現(xiàn)較淺甚至難以分辨的條帶，是因?yàn)镻SC 在提取過(guò)程中胃蛋白酶使其分解成其它小分子，由此也可以看出ASC 比PSC 相對(duì)更純、更完整。

表1 鰈魚骨ASC 和PSC 紅外光譜出峰位置及圖譜解析Table 1 Peak position and analysis of ASC and PSC from flounder bone

圖2 鰈魚骨ASC 和PSC 的紅外吸收光譜圖Fig.2 The infrared spectra of ASC and PSC from flounder bone

2.4 DSC 分析

差示掃描量熱法 （differential scanning calorimetry，DSC）對(duì)于膠原蛋白來(lái)說(shuō)，是一種分辨率高、試樣用量少的熱分析方法。三螺旋和形成膠原分子周圍的水合網(wǎng)絡(luò)的氫鍵之間的斷裂是膠原蛋白產(chǎn)生高焓的原因[23]，DSC 圖譜反映ASC 的熱焊值為7.314 J/g，高于PSC 的熱焊值2.429 J/g，說(shuō)明ACS 具有的交聯(lián)鍵比PSC 的多。聚合物熱穩(wěn)定性是由變性溫度（Td）這一重要指標(biāo)反映出來(lái)的，而Td 是膠原蛋白三螺旋分解成無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)的溫度值[24]，Td 從伸展和三螺旋結(jié)構(gòu)有序卷曲到隨機(jī)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變伴隨著分子質(zhì)量的損失和物理化學(xué)性質(zhì)的改變?？梢酝ㄟ^(guò)圖4直觀地看出鰈魚骨膠原蛋白的峰值溫度分別是ASC 為52.24 ℃，PSC 為49.65 ℃。由于膠原蛋白的熱穩(wěn)定性主要與脯氨酸和羥脯氨酸的吡咯烷環(huán)相連，部分與羥脯氨酸羥基的氫鍵結(jié)合[25]。胃蛋白酶對(duì)端肽的去除可能不利于通過(guò)氫鍵穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致鰈魚骨PSC 的Td 降低。一般情況下，生活在寒冷地區(qū)鰈魚的膠原蛋白羥脯氨酸濃度較低，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性低于生活在溫暖棲息地的鰈魚[26]。

圖3 鰈魚骨膠原蛋白SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis pattern of collagen from flounder bone

2.5 SEM 分析

圖4 鰈魚骨ASC 與PSC 的DSC 圖譜Fig.4 DSC thermogram of ASC and PSC from flounder bone

凍干后的鰈魚骨ASC 與PSC 樣品呈現(xiàn)柔軟白色海綿狀，肉眼可觀察到疏松多絲狀，且ASC顏色呈現(xiàn)純白無(wú)雜質(zhì)，PSC 則呈現(xiàn)白色微黃。通過(guò)在電鏡放大1 000 倍掃描，如圖5（a，b）顯示出纖維狀的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。ASC 相對(duì)PSC 較光滑，結(jié)構(gòu)較均勻，PSC 比ASC 多孔且孔徑較多分布不均勻，這是由于凍干前兩種膠原濃度不同所致[27]。以上特征與Zhang 等[28]研究一致。說(shuō)明胃蛋白酶對(duì)膠原蛋白有結(jié)構(gòu)上的改變，但整體還是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，酸法提取出的膠原蛋白較好地保持了自身結(jié)構(gòu)。兩種膠原蛋白均比較適合作為藥物載體，能夠很好地應(yīng)用到食品、化妝品等領(lǐng)域[29]。

2.6 DHR 分析

圖5 鰈魚骨PSC（a）與ASC（b）掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron micrographs of PSC （a）and ASC （b）from flounder bone

圖6 鰈魚骨ASC 和PSC 膠原蛋白溶液的流變學(xué)曲線Fig.6 Rheological characteristics of collagen solutions of ASC and PSC from flounder bone

鰈魚骨膠原蛋白溶液可通過(guò)振蕩模型測(cè)定其粘彈性，即對(duì)膠原蛋白分子施加一個(gè)扭擺力矩，使其在此力矩下發(fā)生運(yùn)動(dòng)[30]。根據(jù)扭擺力矩頻率從低到高的變化，分子鏈的運(yùn)動(dòng)發(fā)生相應(yīng)的改變并測(cè)定粘彈性[31]。G′表示膠原蛋白分子隨外力的改變發(fā)生形變的能力，G″表示膠原蛋白分子在外力作用發(fā)生改變，分子鏈內(nèi)部或分子間拉伸導(dǎo)致的能量損耗[32]。如圖6所示，振蕩頻率在0.1～4 Hz時(shí)，隨著振蕩頻率的升高，ASC 與PSC 的儲(chǔ)能模量升高且相差不多；在4～10 Hz 振蕩頻率時(shí)，PSC 儲(chǔ)能模量增量顯著高于ASC。如圖7所示，振蕩頻率在0.1～5.5 Hz 時(shí)，兩種膠原蛋白分子損耗模量隨振蕩頻率升高而升高且相差不多；在5.5～10 Hz時(shí)，PSC 的損耗模量增量微高于ASC。說(shuō)明ASC與PSC 的流變學(xué)特性不同，且隨著振蕩頻率的增大，ASC 與PSC 溶液主要表現(xiàn)出彈性特征。PSC 的G′和G″斜率均大于ASC，說(shuō)明在0.1～10 Hz 的頻率下具有較高的凝膠穩(wěn)定性[33]。

3 結(jié)論

本文用鰈魚骨以酸法與酶法提取制備膠原蛋白并研究了其結(jié)構(gòu)及流變學(xué)特性。結(jié)果表明：鰈魚骨ASC 與PSC 在紫外吸收上均在227nm 附近出現(xiàn)最大吸收峰，是典型的Ⅰ型膠原蛋白；紅外光譜與SDS-PAGE 電泳均顯示ASC 與PSC 具有較為完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，是Ⅰ型膠原蛋白；通過(guò)DSC測(cè)出ASC 與PSC 的熱變性溫度分別為52.24 ℃與49.65 ℃，可能是由于兩種方法提取的兩種膠原蛋白存在構(gòu)型差異；通過(guò)電鏡掃描顯示ASC 與PSC 都呈現(xiàn)交織狀纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，ASC 分布相對(duì)更均勻，可作為很好的醫(yī)用材料；流變學(xué)特性顯示在0.1～10 Hz 的振蕩頻率下，ASC 與PSC 的儲(chǔ)能模量與損耗模量都隨著頻率的升高而增大，兩者的溶液主要表現(xiàn)為彈性特征，但PSC 的儲(chǔ)能模量和損耗模量的斜率均大于ASC，因而具有較高的凝膠穩(wěn)定性。綜上，ASC 與PSC 因提取方法不同而存在一些差異，但均適用于食品、保健品、化妝品和藥品等行業(yè)，可根據(jù)實(shí)際要求對(duì)其進(jìn)行應(yīng)用，本研究可為鰈魚加工主要副產(chǎn)物魚骨的綜合利用和開發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。