劉 欣 曹廣添 陶 菲 張素銀 楊喆曦 李永德

（中國計量大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)院 杭州310018）

食物過敏被視為一種嚴(yán)重的公共營養(yǎng)衛(wèi)生問題，引起全球廣泛的關(guān)注[1-2]。大豆是人類和動物主要的蛋白質(zhì)來源之一，同時也是聯(lián)合國規(guī)定的8類主要致過敏食物之一。研究顯示，大豆中的致敏因子極大地影響幼年動物對蛋白質(zhì)的有效吸收，可以引起人和幼年動物發(fā)生過敏反應(yīng)，因而限制了大豆及其制品在食品和飼料工業(yè)中的應(yīng)用[3-4]。

近年來試驗動物模型成為評價蛋白過敏性的一個重要手段。以小鼠、大鼠和豬為過敏動物試驗?zāi)Ｐ偷难芯烤袌蟮繹5-7]。然而，至今仍存在很多因素限制了動物模型的應(yīng)用，比如動物的種類、年齡、性別和對過敏原的敏感性，關(guān)于大豆蛋白的過敏試驗動物模型也鮮有報道。課題組前期試驗結(jié)果表明：Balb/c 小鼠模型是一種有效評估大豆蛋白過敏的動物模型[8-9]。王翠燕等[10]的研究也證明了Balb/c 小鼠動物模型可用于評價大豆球蛋白的致敏性。

雖然目前對食物引發(fā)個體過敏反應(yīng)的具體機制尚不清楚，但是許多研究顯示食物過敏原的致敏途徑是通過胃腸道[11-12]。而食物過敏中黏膜免疫反應(yīng)的產(chǎn)生一般是由腸黏膜本身對食物抗原口服耐受失敗而造成的[13]。黏膜中具有調(diào)節(jié)、抑制功能的T 淋巴細(xì)胞亞群 （Th3，Tr1，CD4+CD25+T 細(xì)胞）數(shù)量及功能下調(diào)，對CD4+T 效應(yīng)細(xì)胞的主動抑制作用降低，導(dǎo)致黏膜中免疫介導(dǎo)的炎癥-抗炎平衡破壞，是細(xì)胞免疫反應(yīng)亢進(jìn)造成腸道損傷的重要原因[14]。目前關(guān)于大豆蛋白過敏原誘導(dǎo)的腸道過敏反應(yīng)發(fā)生機理尚未清楚。

基于此背景，在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，針對目前食品中常見的大豆蛋白中主要過敏成分——大豆球蛋白（glycinin）和β-伴球蛋白（β-conglycinin），用易致敏的Balb/c 小鼠作為試驗動物，通過連續(xù)5周的灌胃方式建立過敏試驗動物模型。從腸黏膜免疫的角度探討大豆球蛋白和β-伴球蛋白誘導(dǎo)Balb/c 小鼠黏膜過敏反應(yīng)的機制，以期為進(jìn)一步研究大豆球蛋白和β-伴球蛋白的過敏機理以及預(yù)防大豆過敏的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆球蛋白和β-伴球蛋白提取方法參照劉欣[15]的試驗方法。T 細(xì)胞亞群免疫組化檢測試劑盒：EnVisionTM+加強試劑盒產(chǎn)品，CD3、CD4 和CD8 均為鼠來源的單克隆抗體及IgA 免疫組化染色盒，均來自丹麥DAKO 公司；α4β7 整合素為鼠來源，美國Santa Cruz；原位凋亡細(xì)胞檢測試劑盒（In Situ Cell Death Detection Kit，Code DMK500 Lot：BK1502），TaKaRa 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XDS-1B 型生物倒置顯微鏡，德國萊卡；DK-8D 型水浴鍋和78HW-1 型恒溫磁力攪拌器，常州金壇市水北康輝實驗廠；MH-1 型微量振蕩器，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；臺式高速低溫冷凍離心機5810R，德國Eppendorf；PTC-200 型熱循環(huán)儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur TM），美國 Bection Dickinson 公司。

1.3 試驗動物

清潔級雌性小鼠Balb/c，體重（20±2）g，6 周齡，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗動物中心（動物生產(chǎn)許可號22-2001001），按Kinpples 等[16]的方法連續(xù)傳兩代，以第3 代雌鼠（6 周齡）作為試驗對象。Balb/c 小鼠按組分籠飼養(yǎng)，自由飲用去離子水與進(jìn)食。動物房溫度19～25 ℃，濕度55%～65%，（不含豆粕）喂養(yǎng)，光照10～12 h/d，鼠籠每周清洗消毒2 次。

1.4 試驗方法

1.4.1 動物分組及模型建立 將6 周齡雌性Balb/c 小鼠隨機分為3 組共96 只，每組32 只，每組4 個重復(fù)，每個重復(fù)8 只，分籠飼養(yǎng)。飼喂顆粒飼料，預(yù)試7d 后，進(jìn)入正式期。按如下方法設(shè)計：

對照組（Saline）：每天分別灌胃1 mL/只生理鹽水；

試驗組 （Glycinin）：每天分別灌胃1 mg/mL glycinin/只；

試驗組（β-conglycinin）：每天分別灌胃1 mg/mL β-conglycinin/只。

連續(xù)灌胃35 d，每天自由采食和飲水，按試驗動物飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)。在試驗第33 天進(jìn)行大豆球蛋白腸道激發(fā)后48 h 處死小鼠，以排除速發(fā)型過敏反應(yīng)對小鼠小腸的影響。

1.4.2 腸黏膜相關(guān)淋巴組織的測定 腸黏膜Peyer's 結(jié)數(shù)量的觀察：參考周華[17]的方法。處死動物后，小心取出全小腸，肉眼計數(shù)小腸Peyper's 結(jié)的數(shù)量。

1.4.3 小鼠小腸絨毛CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞觀察及計數(shù) 采用T 細(xì)胞亞群免疫組化檢測試劑盒（EnVisionTM+加強試劑盒產(chǎn)品）。陽性結(jié)果和分布情況：在小腸黏膜層內(nèi)主要在固有層內(nèi)，定位于單個核細(xì)胞的胞膜和/或胞漿，陽性呈現(xiàn)棕黃色或黃色；量化：顯微鏡下隨機選取5～10 個高倍視野（400 倍），細(xì)胞總數(shù)大于500 個，計算各視野內(nèi)的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，再取均數(shù)。陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)=視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)×100%，然后進(jìn)行整理及統(tǒng)計分析。

1.4.4 TUNEL 法檢測小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞凋亡 采用原位凋亡細(xì)胞檢測試劑盒測試腸絨毛上皮細(xì)胞凋亡的情況。TUNEL 的測量：每張切片在200 倍視野下計數(shù)200 個以上細(xì)胞。每只小鼠選取3 張切片，每組均觀察8 只小鼠。細(xì)胞中陽性的凋亡細(xì)胞數(shù)，換算成凋亡指數(shù)（AI），AI=視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)×100%，然后進(jìn)行整理及統(tǒng)計分析。

1.4.5 小鼠小腸固有層中IgA+漿細(xì)胞檢測 免疫組化檢測試劑盒測試。結(jié)果：IgA+的陽性表達(dá)主要為腸黏膜固有層的炎癥細(xì)胞的胞漿內(nèi)等。陽性呈棕黃色定位于細(xì)胞漿內(nèi)，陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，試驗結(jié)果以平均數(shù)±SD 表示。方差分析差異顯著時采用鄧肯法（Duncan test）進(jìn)行多重比較；差異顯著性水平為P＜0.05。

2 試驗結(jié)果

2.1 腸黏膜Peyer’s 結(jié)數(shù)量的觀察

腸黏膜淋巴集合小結(jié)（PP 結(jié)）數(shù)量的觀察結(jié)果如圖1所示。灌胃大豆球蛋白和β-伴球蛋白組小鼠的PP 結(jié)盡管差異不顯著，但有增加的趨勢（8.13 vs11.25；8.13 vs 11.63）。

2.2 小鼠小腸絨毛T 淋巴細(xì)胞觀察及計數(shù)

圖1 大豆球蛋白和β-半球蛋白對小鼠腸黏膜淋巴集合小結(jié)（PP 結(jié)）數(shù)量的影響Fig.1 Effect of soybean glycinin and β-conglycinin on the number of peyer's patches in the intestinal mucosa of mouse

圖2表明，灌胃glycinin 組的小鼠小腸絨毛固有層中CD3+、CD4+LPL 的數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.01），CD8+的數(shù)量與對照組相比無顯著差異。灌胃β-伴球蛋白組的小鼠小腸絨毛固有層（LPL）中CD3+LPL 和CD8+LPL 的數(shù)量 （P＜0.05）以及CD4+ LPL 的數(shù)量（P＜0.01）顯著高于對照組；兩個試驗組中整合素α4β7 的數(shù)量顯著高于對照組；各組CD4+/CD8+的比值無顯著差異。灌胃大豆球蛋白組的小鼠小腸上皮淋巴細(xì)胞（IEL）中CD3+、CD4+IEL 數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.05），及整合素α4β7的數(shù)量也顯著高于對照組（P＜0.01）；而CD8+IEL和CD4+/CD8+IEL 的數(shù)量均無顯著差異。灌胃β-伴球蛋白組的小鼠小腸中CD3+、CD4+和CD8+IEL數(shù)量及整合素α4β7 的數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.01），CD4+/CD8+的比值也顯著高于對照組（P＜0.05）；CD8+IEL 的數(shù)量與對照組相比無顯著差異。

圖2 各組小鼠小腸絨毛T 淋巴細(xì)胞計數(shù)Fig.2 Effect of soybean glycinin and β-conglycinin on the number of T lymphocyte in intestine

2.3 小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞凋亡觀察及檢測

高倍鏡下觀察顯示灌胃大豆球蛋白和β-伴球蛋白組小鼠小腸出現(xiàn)連續(xù)性陽性染色，固有層中可見大量漿細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，多見陽性染色的淋巴細(xì)胞。對照組中少見陽性染色，LP 中無明顯炎性細(xì)胞浸潤（如圖3所示）。

圖3 各組小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞凋亡觀察 （10×20 倍）Fig.3 Apoptotic cellular observation in murine intestinal epithelium of groups

圖4表明，與對照組相比，灌胃大豆球蛋白和β-伴球蛋白組小鼠上皮細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）。

2.4 小鼠小腸固有層IgA+漿細(xì)胞檢測

圖5表明灌胃大豆球蛋白和β-伴球蛋白的小鼠小腸固有層IgA+漿細(xì)胞檢測情況。由IgA 免疫組化圖片可看出，致敏組小鼠小腸固有層IgA+漿細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的連續(xù)陽性染色，說明腸道的炎癥較高。

圖4 各組小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞凋亡率檢測Fig.4 Apoptotic ratio observation in murine intestinal epithelium of groups

圖5 小鼠小腸固有層IgA+漿細(xì)胞檢測（10×20 倍）Fig.5 IgA+ plasmacyte count in the lamina propria （LP）of Balb/c mice

3 討論

Peyer's 結(jié)是小腸內(nèi)淋巴組織的集結(jié)區(qū)域，單個Peyer's 結(jié)包含有5 個以上的淋巴濾泡，在人體內(nèi)主要集中在回腸末端[18]。濾泡具有中心區(qū)域，富含B 細(xì)胞，其外由混合細(xì)胞包圍。濾泡間含有聚集的T 細(xì)胞，濾泡相關(guān)上皮覆蓋著Peyer's 結(jié)，這有利于其接受腸腔內(nèi)抗原的刺激。濾泡的圓頂區(qū)含有一系列II 型主要組織相容性復(fù)合物（Major histocompatability complex，MHC），這表明抗原呈遞在這些部位發(fā)生。盡管本試驗中致敏組的PP 結(jié)數(shù)量與對照組差異不顯著，但有明顯的增加趨勢，說明大豆球蛋白刺激了小鼠的免疫反應(yīng)。

在食物過敏過程中，腸道是變態(tài)反應(yīng)發(fā)生的主要場所。腸道黏膜免疫是機體防御的第一防線，正常機體的胃腸道生理及免疫屏障能夠避免大多數(shù)食物引起的可能有害的免疫反應(yīng)[19-20]。腸道的上皮部分由上皮細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（Intraepithelial lymphocytes，IEL）構(gòu)成。腸腔內(nèi)存在大量不同的抗原，固有層有許多作用強烈的免疫效應(yīng)細(xì)胞，IEL 則位于腸腔與固有層之間這樣一個特殊的位置。絕大多數(shù)IEL 帶有全T 細(xì)胞的標(biāo)志CD3[21]。固有層的淋巴組織是由一系列的細(xì)胞，包括T、B 淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、主細(xì)胞和少量的中性粒細(xì)胞組成。固有層的T 細(xì)胞可能在腸黏膜非正常破裂時充當(dāng)反應(yīng)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的角色，這種作用有可能被T 細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)（如細(xì)胞因子協(xié)同）。來源于人類和其他靈長類動物的固有層T 細(xì)胞均可合成IL-1α、IL-2β、IL-2、IL-4和IL-5 等細(xì)胞因子[22]。

本試驗研究結(jié)果表明，灌胃大豆球蛋白組的小鼠小腸固有層和上皮間淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+淋巴數(shù)量以及CD4+/CD8+細(xì)胞比值均較正常組增高，提示食物過敏時小鼠小腸固有層存在大量淋巴細(xì)胞浸潤，以CD4+T 細(xì)胞亞群為主。Dreau等[23]研究表明，在飼喂含大豆球蛋白和β-伴球蛋白豆粕的斷奶仔豬腸黏膜上皮細(xì)胞和固有層里，CD4+和CD8+T 細(xì)胞數(shù)量均高于對照組。增加的CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞和血清里高水平的Ig 抗體表明大豆蛋白能夠同時誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫，其它一些文獻(xiàn)也證明了這一點[24-25]。

CD4+和CD8+效應(yīng)T 細(xì)胞的選擇位點與CCR9和α4β7 的表達(dá)量有關(guān)[26]。整合素α4β7（α4β7 integrin）是與食物過敏密切相關(guān)的黏附分子[27]。本試驗發(fā)現(xiàn)灌胃大豆球蛋白組的小鼠小腸固有層和腸道上皮組織間α4β7 的陽性細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組，提示食物過敏時黏膜中免疫效應(yīng)細(xì)胞大量浸潤現(xiàn)象與腸道粘附系統(tǒng)功能異常亢進(jìn)關(guān)系密切。食物過敏時小腸炎癥部位的一系列炎癥因子可上調(diào)粘附系統(tǒng)，加劇病理性T 細(xì)胞向固有層遷移，同時炎癥導(dǎo)致的毛細(xì)管擴張，血流速度下降又可使得淋巴細(xì)胞暴露于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的時間延長，導(dǎo)致T 細(xì)胞表面的整合素得以與黏膜內(nèi)皮粘附分子作用愈發(fā)充分[28]。

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的，不同于壞死的正常生理性細(xì)胞死亡形式，它對維持機體穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。但細(xì)胞異常凋亡如凋亡增強或凋亡延遲將會對機體造成嚴(yán)重的病理損害。當(dāng)致病菌感染機體時，由于內(nèi)毒素、細(xì)胞因子以及其它炎性介質(zhì)的過度釋放，可以誘導(dǎo)不同細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因過度表達(dá)，使這些細(xì)胞出現(xiàn)異常凋亡而損害細(xì)胞的功能[29]。腸道黏膜上皮細(xì)胞及腸道內(nèi)淋巴細(xì)胞均是分化迅速的細(xì)胞，因此也是凋亡比較活躍的細(xì)胞。在某些病理情況下，一旦出現(xiàn)細(xì)胞死亡，就無法逆轉(zhuǎn)。因此，不可避免地對機體造成嚴(yán)重?fù)p害。本試驗?zāi)c道黏膜凋亡的原位觀察中可見灌胃大豆球蛋白組的小鼠小腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)多處細(xì)胞連續(xù)性陽性著色現(xiàn)象，提示食物過敏時小鼠小腸上皮細(xì)胞病理性凋亡亢進(jìn)，上皮屏障功能受損。說明過敏反應(yīng)嚴(yán)重時腸淋巴組織易于發(fā)生細(xì)胞凋亡，這可能是導(dǎo)致過敏后腸道免疫功能低下的重要原因。

IgA 是腸黏膜表面最重要的抗體，至少有80%的漿細(xì)胞位于腸黏膜固有層，分泌大量的IgA，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其它類型的免疫球蛋白[30]。黏膜系統(tǒng)中sIgA 反應(yīng)涉及B 細(xì)胞的一系列活動。smIgA+B細(xì)胞是IgA+漿細(xì)胞的前體，離開PP 誘導(dǎo)部位后，經(jīng)淋巴管、淋巴結(jié)到達(dá)胸導(dǎo)管最后進(jìn)入血液循環(huán)，在粘附分子系統(tǒng)（如MadCAM-1/α4β7）的引導(dǎo)下回到腸黏膜固有層。固有層smIgA+B 細(xì)胞在IL-4，IL-5，IL-6 等一系列細(xì)胞因子的作用下最終分化為IgA+漿細(xì)胞，進(jìn)而向腸腔分泌sIgA 抗體，同時少量smIgA+B 細(xì)胞則儲存在固有層中，成為IgA持續(xù)分泌的重要來源[31]。前期的試驗已經(jīng)證明灌胃β-伴球蛋白組的小鼠小腸黏膜sIgA 含量顯著增加（0.17 μg/mL vs 0.37 μg/mL）（P＜0.01）[11]。本試驗結(jié)果證實致敏組小鼠腸道固有層中B 細(xì)胞向IgA+漿細(xì)胞的分化增加，腸黏膜中sIgA 分泌增加，即表明sIgA 反應(yīng)的一系列體液免疫活動得以加強。這種sIgA 升高等高功能的抗體反應(yīng)過程仍然可能與炎癥狀態(tài)下腸道黏膜“CD8α（-）DC-前體細(xì)胞-CD8α（-）DC-Th2-IL-4-B cell（Plasmacyte）-Ig”軸激活有關(guān)。

4 結(jié)論

大豆球蛋白和β-伴球蛋白過敏小鼠腸黏膜CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，腸上皮細(xì)胞α4β7 表達(dá)量的增加，表明過敏小鼠發(fā)生以腸黏膜CD4+T 細(xì)胞浸潤為主的免疫炎癥反應(yīng)，腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡亢進(jìn)是造成腸道通透性加強進(jìn)而破壞腸黏膜屏障功能的重要原因。同時致敏組固有層IgA+漿細(xì)胞的增加和腸黏膜中sIgA 含量的增加表明大豆球蛋白同時引發(fā)腸道sIgA 體液免疫反應(yīng)。結(jié)果表明大豆球蛋白和β-伴球蛋白可以同時介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。