叢艷君 劉家琦 于曉鳳 呂曉哲 李 曄

（1 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京100048 2 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心 北京100048）

大約有65%的牛乳過(guò)敏病人對(duì)酪蛋白過(guò)敏，而對(duì)酪蛋白過(guò)敏的患者主要對(duì)αs1-酪蛋白產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)[1]。本課題組前期通過(guò)ELISA、免疫印跡試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)αs1-酪蛋白是我國(guó)牛乳過(guò)敏患者潛在的過(guò)敏原[2]。通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)牛乳αs1-酪蛋白的檢測(cè)和評(píng)價(jià)主要是用體外方法，體內(nèi)研究報(bào)道較少[3-4]。

目前報(bào)道的用于過(guò)敏性食品評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型有狗、豚鼠、小鼠和大鼠，最優(yōu)模型還在研究篩選中[5-11]。狗的腸道解剖、生理和營(yíng)養(yǎng)需求與人類相似，豚鼠的皮膚、胃腸道的解剖學(xué)、生理學(xué)和免疫學(xué)也與人類相似[12]，然而這種動(dòng)物與嚙齒類動(dòng)物相比存在一些缺點(diǎn)，如動(dòng)物喂養(yǎng)費(fèi)用昂貴、品種有限、市售的免疫試劑缺乏以及漫長(zhǎng)的致敏過(guò)程（18個(gè)月）[13]。經(jīng)口致敏的牛乳過(guò)敏動(dòng)物模型主要用的是豚鼠[14-15]，然而對(duì)于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的致敏性，它不是一種合適的動(dòng)物模型，因?yàn)殡嗍髮?duì)蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)不同于人類[15]，且缺少合適的研究豚鼠免疫系統(tǒng)的工具[12]。與其它動(dòng)物模型相比，大鼠是毒性試驗(yàn)常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，具有許多優(yōu)點(diǎn)[16]。棕色挪威大鼠因與IgE 的高反應(yīng)特性，故被廣泛用于食物過(guò)敏的研究（使用或不使用佐劑）。轉(zhuǎn)錄分析方法表明小鼠和人類樣本之間表現(xiàn)出顯著的一致性，特應(yīng)性皮炎的研究表明小鼠和人類樣本在基因表達(dá)譜中表現(xiàn)出高度的同源性[17]。此外，小鼠的體積小，繁殖周期短，免疫學(xué)特性好。在復(fù)雜的過(guò)敏反應(yīng)機(jī)制中，還沒(méi)有找到一種可以定量蛋白質(zhì)潛在過(guò)敏性的穩(wěn)定的標(biāo)記物[18]。已經(jīng)報(bào)道的食物過(guò)敏動(dòng)物模型存在諸多不同，如過(guò)敏程度、致敏途徑、致敏原的類型及用量不同，另外佐劑使用類型及用量也不同[19-22]，這就很難用已有的模型進(jìn)行食物致敏性評(píng)價(jià)及治療方法的篩選。BALB/C 小鼠是以Th2 型細(xì)胞應(yīng)答為主導(dǎo)的，對(duì)過(guò)敏原更易感而能夠產(chǎn)生高效價(jià)的IgE，常被用于食物過(guò)敏反應(yīng)的研究[23-24]。有研究顯示雌性小鼠的免疫反應(yīng)性比雄性小鼠更強(qiáng)[25]。

本研究旨在建立αs1-酪蛋白致敏的BALB/C小鼠模型基礎(chǔ)上，通過(guò)測(cè)定小鼠特異性IgE 抗體、肥大細(xì)胞蛋白酶、組胺、細(xì)胞因子水平，并進(jìn)行臨床和病理切片觀察，深入研究αs1-酪蛋白對(duì)機(jī)體的致敏機(jī)理，為評(píng)價(jià)αs1-酪蛋白致敏風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

50 只3～4 周齡SPF 級(jí)雌性BALB/C 小鼠，購(gòu)自北京維通利華公司（許可證號(hào)：SCXK（京）2006-0009）；雞蛋清白蛋白（OVA），上海源葉生物技術(shù)有限公司；霍亂毒素（CT），Sigma 公司；HRP-羊抗鼠IgE 抗體，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素和兩性霉素B，中科邁晨（北京）科技有限公司；胎牛血清（FBS），Hyclone；肥大細(xì)胞蛋白酶試劑盒、組胺試劑盒、細(xì)胞因子IL-4 試劑盒、細(xì)胞因子IL-5 試劑盒、細(xì)胞因子IL-10 試劑盒、細(xì)胞因子IFN-γ 試劑盒，武漢華美有限公司。

1.2 儀器、設(shè)備及其它

550 型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；低溫高速離心機(jī)，SIGMA 公司。清潔級(jí)動(dòng)物房，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心。

2 方法

2.1 αs1-酪蛋白致敏動(dòng)物模型的建立

BALB/C 小鼠在SPF 標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，期間自由攝食和飲水，環(huán)境溫度控制在（23±3）℃，濕度控制在40%～70%。小鼠按體重隨機(jī)分成5 組，每組10 只，分別為卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）陽(yáng)性對(duì)照組 （每次灌胃劑量2 mg/只）、αs1-酪蛋白高劑量組（3 mg/只）、αs1-酪蛋白中劑量組（2 mg/只）、αs1-酪蛋白低劑量組（1 mg/只）、生理鹽水陰性對(duì)照組，其中陽(yáng)性對(duì)照組和αs1-酪蛋白劑量組佐以霍亂毒素（cholera toxin，CT）。前5 周，每隔7 d 經(jīng)口灌胃αs1-酪蛋白或OVA，陰性對(duì)照組給予相同體積的生理鹽水。第42 天，小鼠禁食過(guò)夜后進(jìn)行5 倍質(zhì)量的αs1-酪蛋白或者OVA的大劑量刺激。試驗(yàn)過(guò)程中，每周觀察小鼠的生長(zhǎng)狀況。

大劑量刺激30 min 后，觀察各組動(dòng)物的狀態(tài)，并進(jìn)行致敏癥狀評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0 分：沒(méi)有異常癥狀；1 分：小鼠抓鼻子或撓頭；2 分：眼睛或嘴巴周圍浮腫，毛發(fā)豎立，活動(dòng)減少或呼吸頻率增加；3 分：哮喘，呼吸困難；4 分：大刺激后小鼠抽搐或靜止；5 分：死亡[20]。

2.2 特異性IgE 抗體的測(cè)定

各組動(dòng)物在第42 天免疫之后30 min 時(shí)采血，通過(guò)ELISA 方法測(cè)定血清中特異性IgE 抗體含量[26]。

2.3 肥大細(xì)胞蛋白酶及組胺釋放試驗(yàn)[27]

各組動(dòng)物在第42 天免疫之后30 min 時(shí)通過(guò)眼窩內(nèi)眥靜脈采血，血漿樣本用于組胺水平的測(cè)定，血清樣本用于肥大細(xì)胞蛋白酶水平的測(cè)定。分別使用組胺釋放試劑盒、肥大細(xì)胞蛋白酶ELISA試劑盒參照說(shuō)明書操作。

2.4 細(xì)胞因子的測(cè)定[28]

各組動(dòng)物在第42 天免疫之后30 min 時(shí)取脾淋巴細(xì)胞，低溫500 g 離心5 min，棄去上清，加入1640 完全培養(yǎng)基（90% 1640 不完全培養(yǎng)基，10%胎牛血清），1% 三抗（含有青霉素、兩性霉素B 和鏈霉素）使?jié)舛冗_(dá)到2×105個(gè)/mL，取100μL 的細(xì)胞懸液加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)添加或不添加100 μL/mL 的αs1-酪蛋白，添加αs1-酪蛋白孔作為陽(yáng)性對(duì)照。將細(xì)胞培養(yǎng)板在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h 后，收集動(dòng)物細(xì)胞上清液，使用細(xì)胞因子試劑盒測(cè)上清液中的IL-4、IL-5、IL-10 和IFN-γ 的水平。

2.5 組織病理學(xué)觀察[29]

大劑量刺激后30 min，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取空腸，胸腺，脾臟和肺，在福爾馬林溶液固定，石蠟包埋切片，HE 常規(guī)染色，觀察各臟器是否病變。

2.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組均值用t 檢驗(yàn)分析，差異水平為P＜0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 特異性IgE 抗體的測(cè)定

如圖1所示，αs1-酪蛋白致敏組小鼠特異性抗體IgE 水平顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明成功建立了BALB/C 小鼠模型。OVA 經(jīng)口灌胃誘發(fā)小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性IgE 抗體水平也顯著升高 （P＜0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性。并且αs1-酪蛋白致敏組小鼠產(chǎn)生的特異性IgE 抗體水平隨著灌胃劑量的增加而增加。

圖1 各致敏組小鼠血清中特異性抗體IgE 的光密度值Fig.1 The OD value of specific IgE in sera of sensitized mice

3.2 過(guò)敏癥狀觀察

大劑量刺激后30 min 內(nèi)，各組均有不同數(shù)量的小鼠表現(xiàn)出不同程度的過(guò)敏癥狀，陰性對(duì)照組有2 只小鼠抓鼻子或撓頭，其它8 只小鼠沒(méi)有過(guò)敏癥狀。各蛋白致敏組小鼠中，低、中、高劑量組均有1 只小鼠未表現(xiàn)出過(guò)敏癥狀，其它小鼠都產(chǎn)生了抓鼻子、撓頭、毛發(fā)豎立、活動(dòng)減少等致敏反應(yīng)，甚至，高劑量組1 只小鼠出現(xiàn)哮喘、呼吸困難癥狀。沒(méi)有出現(xiàn)抽搐、死亡癥狀的小鼠。

表1 各致敏組小鼠出現(xiàn)不同癥狀的數(shù)量Table 1 The number of different symptoms appeared in each sensitized group

3.3 肥大細(xì)胞蛋白酶的測(cè)定

如圖2所示，各試驗(yàn)組的肥大細(xì)胞蛋白酶含量都顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），αs1-酪蛋白致敏組小鼠產(chǎn)生肥大細(xì)胞蛋白酶的量隨著灌胃劑量的增加而增加。與OVA 陽(yáng)性對(duì)照組比較，低劑量組、中劑量組均與之差異顯著（P＜0.05），高劑量組差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 各致敏組小鼠血漿中肥大細(xì)胞蛋白酶含量Fig.2 The content of mast cell proteinase in plasma of each sensitized group

3.4 組胺釋放的測(cè)定

如圖3所示，αs1-酪蛋白致敏的中、高劑量組小鼠的組胺釋放量都顯著高于陰性對(duì)照組 （P＜0.05），且產(chǎn)生組胺的量隨著灌胃劑量的增加而增加，低劑量組與陰性對(duì)照組間差異不顯著（P＞0.05）。αs1-酪蛋白致敏的中、低劑量組小鼠產(chǎn)生的組胺量顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 各致敏組小鼠血漿中組胺含量Fig.3 The histamine content in plasma of each sensitized group

3.5 細(xì)胞因子的測(cè)定

各組小鼠第42 天大劑量刺激后，檢測(cè)脾細(xì)胞中IL-4、IL-5、IL-10 和IFN-γ 的水平。

如圖4所示，各劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-4 含量與陰性對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），且αs1-酪蛋白免疫組中IL-4 含量隨著致敏劑量的增加呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。低、中劑量組IL-4含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異不顯著 （P＞0.05），高劑量組IL-4 含量高于陽(yáng)性對(duì)照組，數(shù)值為214.18 pg/mL，差異顯著（P＜0.05）。

如圖5所示，各劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-10 含量與陰性對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），且αs1-酪蛋白各劑量致敏組IL-10 含量隨著致敏劑量的增加而增加。低劑量組和中劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-10 含量低于陽(yáng)性對(duì)照組，數(shù)值分別為999.36，1 180.99 pg/mL，差異顯著（P＜0.05），高劑量組也低于陽(yáng)性對(duì)照組，數(shù)值為1 224.57 pg/mL，但是差異不顯著（P＞0.05）。

如圖6所示，各劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-5 含量與陰性對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），且各劑量組小鼠IL-5 含量隨著致敏劑量的增加呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。低劑量組小鼠IL-5 含量低于陽(yáng)性對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05），中劑量組小鼠IL-5 含量低于陽(yáng)性對(duì)照組，差異不顯著（P＞0.05），高劑量組高于陽(yáng)性對(duì)照組，數(shù)值為34.98 pg/mL，差異不顯著（P＞0.05）。

如圖7所示，各劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子IFN-γ 含量與陰性對(duì)照組相比均差異顯著（P＜0.05），低劑量組小鼠IFN-γ 含量高于陽(yáng)性對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05），中劑量組小鼠IFN-γ 含量高于陽(yáng)性對(duì)照組，數(shù)值為523.80 ng/L，差異不顯著（P＞0.05），高劑量組含量低于陽(yáng)性對(duì)照組，數(shù)值為509.04 ng/L，差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 各致敏組小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-4 的分泌情況Fig.4 Secretion of cytokine IL-4 in splenic lymphocyte of each sensitized group

圖5 各致敏組小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-10 的分泌情況Fig.5 Secretion of cytokine IL-10 in splenic lymphocyte of each sensitized group

圖6 各致敏組小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-5 的分泌情況Fig.6 Secretion of cytokine IL-5 in splenic lymphocyte of each sensitized group

圖7 各致敏組小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ 的分泌情況Fig.7 Secretion of cytokine IFN-γ in splenic lymphocyte of each sensitized group

3.6 組織病理學(xué)觀察

通過(guò)組織病理學(xué)觀察，可以看出陰性對(duì)照組的小鼠各臟器均呈現(xiàn)正常形態(tài) （圖8，1a、1b、1c、1d），而αs1-酪蛋白各劑量組小鼠的肺、脾臟、胸腺和小腸均有不同程度的炎癥變化。αs1-酪蛋白低劑量組的小鼠局部肺泡充氣過(guò)度，擴(kuò)張，肺泡隔增寬（圖8，2a），脾臟紅髓充血，邊緣竇有少量淋巴節(jié)病灶（圖8，2b），胸腺形態(tài)未見(jiàn)明顯異常（圖8，2c），小腸黏膜間質(zhì)有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖8，2d）。αs1-酪蛋白中劑量組的小鼠有明顯臟器的炎性病理特征。小鼠局部肺泡隔塌陷，少量肺泡代償性擴(kuò)張（圖8，3a），脾臟紅髓充血，邊緣竇有較多淋巴灶（圖8，3b），胸腺內(nèi)有淋巴灶產(chǎn)生（圖8，3c），小腸黏膜間質(zhì)有較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖8，3d）。αs1-酪蛋白高劑量組的小鼠臟器的炎性病理特征更為明顯。小鼠局部肺泡隔增厚，少量肺泡代償性擴(kuò)張，局部肺泡少量出血（圖8，4a），脾臟紅髓充血，局部邊緣竇有條索狀淋巴灶（圖8，4b），胸腺髓質(zhì)內(nèi)有較大的淋巴灶（圖8，4c），小腸黏膜間質(zhì)有較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖8，4d）。

陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠臟器的炎性病理特征也較為明顯。小鼠局部肺泡隔增厚，肺泡代償性擴(kuò)張，充氣過(guò)度（圖8，5a），脾臟紅髓充血，有較多淋巴灶，有灶性壞死（圖8，5b），胸腺髓質(zhì)內(nèi)有較大的淋巴灶（圖8，5c），小腸黏膜間質(zhì)有較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖8，5d）。

圖8 各致敏組小鼠肺、脾臟、胸腺和小腸等組織的病理切片F(xiàn)ig.8 Pathological sections of the lung，spleen，thymus and small intestine of the sensitized mice

4 討論

食物過(guò)敏動(dòng)物試驗(yàn)一個(gè)潛在的爭(zhēng)議問(wèn)題是致敏途徑的選擇，常用的致敏途徑是腹腔注射和口服灌胃[30-32]。在不添加佐劑時(shí)，注射方式可能比口腔灌胃更易引起動(dòng)物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，但這與人體經(jīng)過(guò)口腔攝入過(guò)敏原后引起機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)方式不同?？谇还辔概c人體攝入致敏原的方式相似，但易使經(jīng)過(guò)敏原處理的動(dòng)物產(chǎn)生免疫耐受[33-34]，因此一般會(huì)使用相應(yīng)的佐劑來(lái)避免產(chǎn)生耐受，本研究采用CT 作為佐劑。CT 是迄今研究比較深入、效果比較好的黏膜免疫佐劑之一[35]。CT 由一個(gè)毒性A 亞單位與五聚體B 亞單位共價(jià)連接而成，本研究同之前報(bào)道的文獻(xiàn)相同[36-37]，用無(wú)毒的B 亞單位免疫小鼠，CT-B 與存在于所有有核細(xì)胞表面的唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞膜構(gòu)型改變，同時(shí)通過(guò)刺激內(nèi)源性腺苷酸環(huán)化酶活性，使cAMP 合成增加而發(fā)揮佐劑作用[38]。

T（CD4+）細(xì)胞作為過(guò)敏效應(yīng)性細(xì)胞，當(dāng)與牛乳等抗原相遇，能夠分化為成熟的效應(yīng)性TH （Thelper）細(xì)胞，并分泌細(xì)胞因子，根據(jù)分泌的細(xì)胞因子不同，可分為Thl 和Th2 細(xì)胞，Thl 細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2 和TNF-α，負(fù)責(zé)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，Th2 細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13，能夠有效激活B 細(xì)胞產(chǎn)生IgE 抗體，IgE 與肥大細(xì)胞結(jié)合導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放細(xì)胞蛋白酶、組胺等介質(zhì)，啟動(dòng)針對(duì)特異性抗原的過(guò)敏反應(yīng)[39]。細(xì)胞蛋白酶、組胺是評(píng)價(jià)細(xì)胞脫顆粒的重要指標(biāo)[40]。

本研究中αs1-酪蛋白致敏組均可誘發(fā)小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性IgE 抗體，且顯著高于陰性對(duì)照組小鼠，這與Fotschki 等[41]用β-乳球蛋白、α-酪蛋白（用鋁作為佐劑）致敏BALB/C 小鼠，血清特異性IgE 抗體含量顯著升高的結(jié)論一致。并且驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)室體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)αs1-酪蛋白具有潛在的致敏性的結(jié)論[2]。與陰性對(duì)照組小鼠比較，αs1-酪蛋白致敏小鼠的肥大細(xì)胞蛋白酶、組胺含量均顯著升高，Th2 細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5、IL-10 水平隨著致敏劑量的增加呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)。Xuanyi Meng等[42]用α-乳白蛋白免疫BALB/C 小鼠（用CT 作為佐劑），Th2 細(xì)胞因子水平顯著升高。Hodgkinson等[43]用從山羊奶中分離純化的αs1-酪蛋白致敏BALB/C 小鼠，建立了動(dòng)物模型，小鼠血清特異性IgG1 和IgE 含量均顯著增高，肥大細(xì)胞蛋白酶含量較對(duì)照組增加了10 倍，細(xì)胞因子IL-4 和IL-10水平顯著增加。

本研究數(shù)據(jù)表明，Th1 細(xì)胞分泌的IFN-γ 也呈增加趨勢(shì)，且高中低劑量組均高于陰性對(duì)照組小鼠，Th1 型細(xì)胞分泌的以IFN-γ 為主的細(xì)胞因子，對(duì)Th2 型過(guò)敏反應(yīng)起抑制作用，二者之間互相制約，兩亞群之間的平衡是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的基本方式[44]。病理切片結(jié)果進(jìn)一步顯示，αs1-酪蛋白中劑量和高劑量組小鼠局部肺泡隔塌陷或增厚，脾臟和胸腺中有淋巴灶產(chǎn)生，且小腸黏膜間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。一般情況下機(jī)體的胃腸道特異性和非特異性黏膜屏障系統(tǒng)可以限制蛋白質(zhì)抗原片段侵入，從而減輕對(duì)食物蛋白的過(guò)敏反應(yīng)，但是過(guò)敏體質(zhì)的個(gè)體消化道屏障功能較差，食物過(guò)敏原片段容易穿過(guò)腸黏膜，從而引起炎癥反應(yīng)[45-46]。

卵清白蛋白（OVA）是雞蛋清中的一種蛋白質(zhì)，經(jīng)常引起人發(fā)生強(qiáng)烈過(guò)敏反應(yīng)，因此它被作為過(guò)敏原廣泛用于各種疾病模型[47-49]。本研究結(jié)果表明，OVA 致敏的小鼠體溫顯著降低，分泌的特異性IgE 含量、細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ均顯著高于陰性對(duì)照組小鼠，肥大細(xì)胞蛋白酶、組胺含量均顯著升高，小鼠的肺、脾臟、胸腺和小腸均有不同程度的炎癥變化。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，即用生理鹽水代替OVA、αs1-酪蛋白，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，小鼠體溫、IgE、肥大細(xì)胞蛋白酶、組胺含量均保持穩(wěn)定狀態(tài)，小鼠肺、脾臟、胸腺和小腸各臟器均呈現(xiàn)正常形態(tài)。

關(guān)于食物過(guò)敏蛋白的研究方法很多，但動(dòng)物模型因其能直接、準(zhǔn)確的反應(yīng)食物過(guò)敏原致敏特性而被廣泛使用。在牛乳過(guò)敏研究中，BALB/C 小鼠是常用的動(dòng)物模型，因?yàn)樾∈髮?duì)牛乳蛋白產(chǎn)生胃腸道過(guò)敏反應(yīng)進(jìn)而產(chǎn)生特異性IgE 抗體的模式與人類相似[20]，并且有研究表明用牛乳β-乳球蛋白過(guò)敏原口服致敏BALB/C 小鼠，可以誘導(dǎo)IgE 抗體顯著升高[50-52]。因此本研究選用雌性BALB/C 小鼠評(píng)價(jià)αs1-酪蛋白致敏特性，首先通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定小鼠αs1-酪蛋白無(wú)致敏劑量及最大過(guò)敏致死劑量（用CT 作佐劑），然后確定高中低劑量組進(jìn)行正式動(dòng)物試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明BALB/C 小鼠特異性IgE 抗體顯著升高，易產(chǎn)生Th2 型細(xì)胞因子，并表現(xiàn)出明顯的炎癥癥狀，能模擬臨床過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生而用于食物過(guò)敏癥研究[53-54]。

5 結(jié)論

本研究在建立αs1-酪蛋白致敏的BALB/C 小鼠模型基礎(chǔ)上，揭示了αs1-酪蛋白的致敏機(jī)理，即αs1-酪蛋白可以誘導(dǎo)小鼠血液中的特異性IgE 抗體、肥大細(xì)胞蛋白酶、組胺含量均顯著升高，Thl 和Th2 細(xì)胞分泌的因子IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ 含量均顯著升高，且隨著致敏劑量的增加而增加。組織病理切片結(jié)果顯示，αs1-酪蛋白中、高劑量組小鼠均產(chǎn)生了明顯的炎癥反應(yīng)，局部肺泡隔塌陷或增厚，脾臟和胸腺中有淋巴結(jié)病灶產(chǎn)生，且小腸黏膜間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。