胡丹丹 楊國良 陳素珍 樓黎明 張 弘

肺癌是臨床常見惡性腫瘤，氣陰兩虛為肺癌主要的中醫(yī)證候特點(diǎn)，益氣養(yǎng)陰治法則為中醫(yī)治療肺癌的重要治療原則[1-2]。益氣養(yǎng)陰方為已故中醫(yī)腫瘤專家施志明教授的經(jīng)驗(yàn)方，主要功效為益氣養(yǎng)陰，解毒散結(jié)。臨床觀察表明，其可延長肺癌患者生存期，緩解臨床癥狀，改善生活質(zhì)量，并可在一定程度上提高機(jī)體免疫力[3-4]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，益氣養(yǎng)陰方可減少CD4+CD25+Treg 細(xì)胞分化，抑制Lewis 肺癌移植小鼠腫瘤生長[5]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討益氣養(yǎng)陰方對Lewis 肺癌移植模型小鼠免疫重塑相關(guān)因子白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 近交系C57BL/6 純系小鼠30 只，6～8 周齡，體質(zhì)量18～20g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物責(zé)任有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002。動物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心進(jìn)行，使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184。實(shí)驗(yàn)動物管理及福利倫理審查決議編號：ZSLL-2017-132。

1.2 實(shí)驗(yàn)瘤株 小鼠Lewis 肺癌瘤株，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.3 中藥復(fù)方 中藥復(fù)方益氣養(yǎng)陰方由生黃芪、白術(shù)、北沙參、麥冬、七葉一枝花、山萸肉、仙靈脾等組成。方藥選取及制備由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院中藥房提供。加水煎煮提取2 次后過濾、沉淀，濃縮成每亳升含生藥2g 的濃度，4℃冰箱保存。

1.4 主要試劑和儀器 Nivolumab（MCE，批號160681000140101）；BCA 法蛋白定量試劑盒（Multisciences，目錄號PQ0011）；Mouse IL-10 ELISA Kit（Multisciences，批號121071151）；Mouse TGF-β ELISA Kit（Multisciences，批號128171045）；酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan MK3，Thermo），渦旋振蕩器（Vortex KB3，Kylin-Bell）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物模型制備 小鼠Lewis 肺癌瘤株由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心傳代保種，待瘤體長至直徑1～1.5cm 時，處死小鼠，選擇生長良好的瘤組織，剪成瘤組織小塊，用200 目不銹鋼篩網(wǎng)摩擦，過濾制成密度為1×106/mL 瘤細(xì)胞懸液，于每只造模小鼠右腋下接種0.2mL 細(xì)胞懸液，全程無菌操作。

2.2 分組及干預(yù) 造模后，待腫瘤增殖至可觸及時，將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、中藥組及西藥組，每組10 只。模型組只予造模，不予藥物干預(yù)。中藥組給予灌胃益氣養(yǎng)陰方懸液（生藥含量2g/mL），1天1 次，0.4mL/次，給藥劑量均根據(jù)人鼠體表面積折合法計(jì)算。西藥組將Nivolumab 按照0.273mg/10g 溶于0.2mL 生理鹽水中腹腔注射，每2 周1 次。各組均常規(guī)喂食。造模第2 天就開始給藥，給藥3 周。造模第7 天開始觀察記錄各組小鼠瘤體大小（每3 天測1次瘤體大?。?。

2.3 樣本制備 各組小鼠脫頸椎處死，快速完整剝離腋窩皮下腫瘤瘤體，標(biāo)重后置于液氮中后保存于-80℃冰箱中備用。

2.4 檢測指標(biāo)及方法

2.4.1 繪制腫瘤體積變化曲線 自造模第7 天起，每3 天用游標(biāo)卡尺測一次小鼠皮下腫瘤長短徑，計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積（V）=腫瘤長徑×腫瘤短徑2/2；取均值繪制腫瘤體積變化曲線。

2.4.2 測定抑瘤率 3 周后脫頸椎處死小鼠，完整剝離腋窩皮下腫瘤瘤體，采用電子天平精確稱取瘤重以及去除腫瘤后的小鼠體質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=［（對照組平均瘤重-用藥組平均瘤重）/對照組平均瘤重］×100%。

2.4.3 ELISA 法檢測各組腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達(dá) 制備腫瘤組織勻漿，Bradford 法測定蛋白定量。分別按Mouse IL-10 ELISA Kit 及Mouse TGF-β ELISA Kit 說明書進(jìn)行操作。

2.4.4 Westem blot 法檢測各組腫瘤組織Foxp3 蛋白表達(dá) 蛋白抽提，Bradford 法測定蛋白含量；根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品，于100℃水浴3min 后上樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳；電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；3%BSA 溶液封閉后，加入Foxp3Ⅰ抗（1：1000），置4℃冰箱振蕩孵育過夜TBST 洗膜后，加入HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶10000）室溫反應(yīng)1h TBST 洗滌后，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑于暗室中顯影，X 光膠片曝光，拍照。

2.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量 將小鼠淋巴細(xì)胞分離液取出恢復(fù)至室溫，無菌條件下，取1mL 淋巴細(xì)胞分離液加入到合適的離心管中。取1mL 小鼠全血，與等量不含Ca2+和Mg2+的PBS 緩沖液混勻，小心加到淋巴細(xì)胞分離液液面上方。室溫下，1500rpm，離心15min。小心吸取第2 層細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至4～5mL 不含Ca2+和Mg2+的PBS 緩沖液離心管中，充分混勻后，1500rpm 離心20min。沉淀經(jīng)反復(fù)洗滌2 次即所得細(xì)胞。樣本管中加入anti-Mouse CD4 FITC 0.25μL 和anti-Mouse CD25 APC0.30μL，渦旋振蕩混勻，室溫避光孵育15min。加入1mL 固定/破膜工作液，渦旋混勻。室溫避光孵育45min。孵育結(jié)束后，無需洗滌，直接加入2mL 1X 破膜緩沖液，1500rpm，離心5min，棄上清。重復(fù)2 次。加入100μL 1X 破膜緩沖液重懸細(xì)胞，樣本管中加入抗體anti-Mouse Foxp3 PE 2.5μL，對應(yīng)的對照管中加入等量的同型對照，室溫避光孵育45min。加入2mL 1X 破膜緩沖液，1500rpm，離心5min，棄上清。重復(fù)2 次。每管加入500μL Flow cytometry Staining buffer，流式上機(jī)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，各項(xiàng)指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。根據(jù)不同數(shù)據(jù)分別采用χ2檢驗(yàn)、方差分析，方差齊性選用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s T3 法檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠腫瘤體積與抑瘤率比較 經(jīng)藥物干預(yù)后，與模型組比較，中藥組及西藥組腫瘤體積增長均減慢，西藥組腫瘤體積明顯減慢，中藥組次之（見圖1）。各組抑瘤率比較，中藥組抑瘤率23.07%，西藥組抑瘤率37.55%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組腫瘤體積變化

3.2 各組腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達(dá)比較 經(jīng)藥物干預(yù)后，與模型組比較，中藥組及西藥組腫瘤組織IL-10、TGF-β 含量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與中藥組比較，西藥組腫瘤組織IL-10、TGF-β含量降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達(dá)比較（pg/mL，）

表1 各組腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達(dá)比較（pg/mL，）

注：模型組僅造模，不予藥物干預(yù)；中藥組給予灌胃益氣養(yǎng)陰方懸液；西藥組將Nivolumab 溶液腹腔注射；IL-10 為白介素10；TGF-β 為轉(zhuǎn)化生長因子β；與模型組比較，aP＜0.05，與中藥組比較，bP＜0.05

3.3 各組腫瘤組織Foxp3 表達(dá)比較 西藥組和中藥組腫瘤組織Foxp3 表達(dá)均明顯低于模型組（P 均＜0.05）；西藥組腫瘤組織Foxp3 表達(dá)明顯低于中藥組（P＜0.05）。見表2、圖2。

3.4 各組外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比例變化比較 外周血流式細(xì)胞檢測CD4+CD25+Treg 細(xì)胞結(jié)果顯示，西藥組、中藥組CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比例均顯著低于模型組（P 均<0.05）；西藥組CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比例顯著低于中藥組（P<0.05）。見表3、圖3。

表2 各組腫瘤組織Foxp3 表達(dá)比較（）

表2 各組腫瘤組織Foxp3 表達(dá)比較（）

注：模型組僅造模，不予藥物干預(yù)；中藥組給予灌胃益氣養(yǎng)陰方懸液；西藥組將Nivolumab 溶液腹腔注射；Foxp3 為轉(zhuǎn)錄因子p3；與模型組比較，aP＜0.05，與中藥組比較，bP＜0.05

圖2 各組腫瘤組織Foxp3 表達(dá)情況

表3 各組外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比例變化比較（%，）

表3 各組外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比例變化比較（%，）

注：模型組僅造模，不予藥物干預(yù)；中藥組給予灌胃益氣養(yǎng)陰方懸液；西藥組將Nivolumab 溶液腹腔注射；與模型組比較，aP＜0.05，與中藥組比較，bP＜0.05

圖3 各組外周血CD4+CD25+Treg 細(xì)胞計(jì)數(shù)

4 討論

機(jī)體免疫系統(tǒng)具有對抗腫瘤以及對腫瘤重新塑型的功能，后者稱之為“免疫重塑”[6]。腫瘤細(xì)胞在免疫重塑過程中可釋放大量細(xì)胞因子，如IL-10、TGFβ，后者可削弱細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）、自然殺傷細(xì)胞（NK）的殺傷活性，逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[7-8]。其中，IL-10 是參與腫瘤免疫逃逸的重要免疫抑制因子，具有雙向免疫調(diào)節(jié)特性，其介導(dǎo)免疫抑制機(jī)制可通過作用于不同免疫細(xì)胞亞群，多途徑發(fā)揮免疫抑制作用，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[9]。TGF-β則是腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫抑制因子，其可促進(jìn)腫瘤組織血管生成、加速腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用，抑制機(jī)體免疫，利于腫瘤生長及加速其浸潤轉(zhuǎn)移；同時其可直接或間接作用于免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)其功能缺失，幫助腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[10-11]。在肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等多種癌組織發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3 表達(dá)與腫瘤高侵襲性及腫瘤組織Treg 細(xì)胞比例呈明顯正相關(guān)，說明Foxp3 是一種促癌因子，而對T 細(xì)胞分化的影響研究證明，F(xiàn)oxp3 表達(dá)與CD4+CD25+Treg 細(xì)胞分化形成有明顯的相關(guān)性[12-15]。而后者可抑制T 殺傷效應(yīng)T 細(xì)胞，參與腫瘤免疫逃逸及腫瘤免疫重塑。

前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，益氣養(yǎng)陰方聯(lián)合化療可下調(diào)CD4+CD25+Treg 細(xì)胞數(shù)量，抑制Lewis 肺癌移植小鼠腫瘤生長[16-17]。本研究結(jié)果示，中藥組抑制肺癌移植瘤生長的作用與西藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。中藥組可明顯降低腫瘤組織IL-10、TGF-β 含量，降低程度雖不及西藥組，但表明益氣養(yǎng)陰方可降低腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達(dá)，改善細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫重塑作用。同時本研究發(fā)現(xiàn)，中藥組可降低移植小鼠腫瘤組織中Foxp3的表達(dá)，該組小鼠外周血中CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比例也明顯降低，說明中藥益氣養(yǎng)陰復(fù)方的免疫重塑作用可能是通過調(diào)節(jié)Foxp3 表達(dá)，影響CD4+CD25+Treg 細(xì)胞分化。

綜上所述，益氣養(yǎng)陰方可通過調(diào)節(jié)Foxp3 表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤CD4+CD25Treg 細(xì)胞分化，降低腫瘤組織IL-10、TGF-β 表達(dá)，改善細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)，調(diào)節(jié)腫瘤免疫重塑來抑制Lewis 肺癌移植小鼠腫瘤生長。