李惠，蔡麗麗，徐建玲，徐艷春，付宇

（1.大慶市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 大慶 163461；2.大慶市第二醫(yī)院感染科，黑龍江 大慶 163461；3.大慶油田總醫(yī)院，黑龍江 大慶 163001）

布魯菌是一類(lèi)人畜共患病病原體，布魯氏感染（布?。┧斐傻奈：κ请p重的，既影響人的身體健康，又影響畜牧業(yè)發(fā)展，并可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。人患此病常因誤診誤治而轉(zhuǎn)成慢性，反復(fù)發(fā)作，長(zhǎng)期不愈[1-4]。而在目前實(shí)驗(yàn)室為臨床提供診斷布魯菌感染的檢測(cè)方法有病原體的分離培養(yǎng)和鑒定、血清學(xué)檢測(cè)等。由于布魯菌進(jìn)入人體后，被中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬，成為胞內(nèi)寄生菌。在感染早期采血分離單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用熒光PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)以提高檢出率。期望給診斷困難的疑似布魯菌病患者提供可靠的診斷依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 97份血液標(biāo)本，其中布魯菌臨床陽(yáng)性病人單個(gè)核細(xì)胞液標(biāo)本30份，健康對(duì)照單個(gè)核細(xì)胞液32份，待測(cè)組病人單個(gè)核細(xì)胞液標(biāo)本35份，上述陽(yáng)性及待測(cè)標(biāo)本均來(lái)自我院門(mén)診及住院就診患者，健康對(duì)照標(biāo)本選自市區(qū)健康體檢者。標(biāo)本采用EDTA抗凝，分離單個(gè)核細(xì)胞，-20 ℃冷凍保存，分批檢測(cè)。

1.1.2 試劑 引物與探針、UGD酶、Taq酶、dNTP試劑盒由北京旌準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司提供。

1.1.3 儀器 上海宏石全自動(dòng)PCR分析儀、旋渦混合器、生物安全柜、干式恒溫儀、高速冷凍離心機(jī)、96孔PCR板。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理和核酸提取 采用商品化的核酸提取試劑盒，使用天根生化科技有限公司核酸提取試劑（YDP304-03，體外診斷試劑備案號(hào)；京海械備20160019）直接從外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取核酸。

1.2.2 PCR擴(kuò)增程序 UDG酶反應(yīng)37 ℃×2 min；預(yù)變性95 ℃×5 min；變性94 ℃×15 s熒光信號(hào)采集94 ℃×35 s；熒光循環(huán)次數(shù)45。

1.2.3 試驗(yàn)結(jié)果的讀取 基線的起始點(diǎn)設(shè)定在6，終止點(diǎn)設(shè)定在12，閾值線設(shè)定在0.12，測(cè)得樣本的Ct值。

1.2.4 質(zhì)量控制 試劑盒自帶內(nèi)標(biāo)，陰性及陽(yáng)性質(zhì)控品。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)標(biāo) 所有反應(yīng)孔內(nèi)標(biāo)通道出現(xiàn)S型曲線，Ct值≤35。

2.2 陰性質(zhì)控品 靶基因通道無(wú)S型曲線。

2.3 陽(yáng)性質(zhì)控品 靶基因通道有S型擴(kuò)增曲線，測(cè)定范圍Ct值≤35。

2.4 97份標(biāo)本，其中臨床診斷布病陽(yáng)性病人標(biāo)本30例，熒光PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性19例，陽(yáng)性率為63.3%，PCR結(jié)果與RBPT符合率為46.7%，與SAT符合率為46.7%；健康對(duì)照32人熒光PCR陰性32例，符合率100.0%，與血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果符合率100.0%；臨床觀察待檢35例病人熒光PCR陽(yáng)性7例，陽(yáng)性率為20.0%，PCR結(jié)果與RBPT符合率為20.0%。見(jiàn)表1。

3 討論

本研究所采用的基于TaqMan探針布魯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)不同的臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示所采用的熒光PCR的敏感性、特異性在疾病的早期診斷上優(yōu)于實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測(cè)，對(duì)于早期感染患者的確診具有十分重要的作用。該方法適用于檢測(cè)布魯氏菌病早期血培養(yǎng)或凝集試驗(yàn)陰性的患者，可用于臨床上布魯氏菌病早期感染的診斷。

表1 97份單個(gè)核細(xì)胞液熒光PCR檢測(cè)結(jié)果與血清學(xué)測(cè)試結(jié)果比較