馮程程,于 筠,王春玲

(天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院,天津 300457)

甘薯(IpomoeabatatasL. Lam.),旋花科甘薯屬一年生或多年生蔓生草本,又稱番薯、山芋、紅薯、地瓜等[1]。紫甘薯屬于一種特殊的甘薯品種[2],含有豐富的膳食纖維和花青素,還含有維生素(B1、B2、C和E)、礦物質(zhì)(鈣、鎂、鉀、鋅和硒)[3],糖蛋白、胡蘿卜素和去氫表雄(甾)酮等多種功能性因子[4]。因此具有一定的抗氧化[5]、抗炎、抗突變[6]、抗腫瘤[7]、預防高血壓、增強機體免疫力、輔助預防和治療心血管疾病[8]的作用。其生產(chǎn)及應用受到越來越多的關(guān)注,因此鮮切紫甘薯具有較好的發(fā)展前景。然而,鮮切果蔬由于剝皮、切片、切碎等操作過程會導致果蔬表面細胞破壞[9],造成果蔬組織失水、腐爛[10-11]以及出現(xiàn)褐變等不良問題。而褐變現(xiàn)象正是鮮切產(chǎn)品保鮮、保質(zhì)面臨的技術(shù)難點[12]。褐變導致的品質(zhì)損壞現(xiàn)象嚴重影響鮮切紫甘薯最終產(chǎn)品的可食用質(zhì)量和消費者對產(chǎn)品的購買欲,直接導致貨架期的縮短。

褐變主要分為酶促褐變和非酶促褐變,而果蔬的褐變主要是酶促褐變。植物組織細胞中,酚類物質(zhì)和酶類通過膜系統(tǒng)區(qū)域化分布不直接接觸,多酚類物質(zhì)存在于液泡內(nèi),而酚酶多分布在細胞質(zhì)內(nèi),所以即使有O2存在的條件下也不會發(fā)生酶促褐變;鮮切果蔬由于切分等脅迫條件導致細胞膜系統(tǒng)的完整性遭到破壞,褐變底物酚類物質(zhì)與褐變相關(guān)酶接觸,當有O2參與時,酚類物質(zhì)會被氧化成醌類物質(zhì),進行一系列的反應,最后聚合形成黑、褐色物質(zhì),從而引起果蔬的褐變,損害產(chǎn)品的感官特性[13]。Nobuyuki等[14]發(fā)現(xiàn)甘薯褐變區(qū)域還原糖、多酚氧化酶(PPO)活性、綠原酸、過氧化氫(H2O2)含量較高。高路等[15]研究表明甘薯褐變是由多酚氧化酶引起的酶促褐變。王禮群等[16]發(fā)現(xiàn)甘薯的苯丙氨酸解氨酶可導致酚類物質(zhì)的積累。

目前,雖然國內(nèi)外有部分對鮮切甘薯褐變的相關(guān)研究,但基本停留在有關(guān)色度和褐變度等感官方面指標的測定以及抑制褐變保鮮方法的探究。因紫甘薯與其他甘薯相比具有富含花青素的特殊性,針對于鮮切紫甘薯貯藏過程中褐變機理的研究卻較少。因此,通過確定鮮切紫甘薯褐變相關(guān)酶和褐變底物,探討鮮切紫甘薯褐變機理,對控制鮮切紫甘薯的褐變有重要意義,為紫甘薯的護色保鮮提供理論參考,以期為鮮切紫甘薯產(chǎn)品的開發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫甘薯品種為紫羅蘭 天津金元寶農(nóng)貿(mào)市場,挑選大小基本一致、無機械傷和病蟲害的新鮮紫甘薯;乙醇、濃鹽酸、福林酚試劑 分析純,天津市天工化工廠;次氯酸鈉 分析純,天津市北方醫(yī)化學試劑廠;無水碳酸鈉 分析純,天津市化學試劑一廠;醋酸鈉、乙酸 分析純,天津市北洋第一化工廠;聚乙二醇PEG6000 分析純,無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司;交聯(lián)聚維酮、Triton X-100 純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈 色譜純,河北東華化工廠;沒食子酸、綠原酸、阿魏酸、兒茶酚、焦性沒食子酸、蘆丁、咖啡酸、叔丁基對苯二酚、L-苯丙氨酸、愈創(chuàng)木酚 HPLC≥98%,上海源葉生物科技有限公司。

CPA電子分析天平 德國Sartorius公司;SCOUT SE式電子天平 美國OHAUS公司;DZ-400 2F型真空包裝機 大江機械設(shè)備有限公司;高速勻漿機 上海標本模型廠;L550型離心機 湘儀離心機儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 鄭州長城工貿(mào)有限公司;MULTISKAN GO酶標儀、紫外可見分光光度計、C-18色譜柱 美國Thermo公司;FE20/EL20型PH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;制冰機 日本SANYO公司;LC-20A型高效液相色譜儀 日本島津公司;微量進樣器 Socorex;0.45 μm濾膜 美國Amresco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試樣處理 實驗前用75%乙醇對所有實驗用具進行消毒處理。將原料經(jīng)200 μL/L的次氯酸鈉溶液[17]浸洗2 min后,用蒸餾水沖洗干凈,用紗布擦干后,快速削皮,切成5 mm厚的紫甘薯片,真空包裝后置于4、12 ℃冰箱中儲存,每2 d測定一次指標。每個指標重復測定三次,結(jié)果取平均值。以蒸餾水處理組作為對照。

1.2.2 褐變度與褐變度變化量的測定 取2.0 g紫甘薯樣品,加入10 mL 80%乙醇溶液,使用高速勻漿機研磨成漿,室溫避光放置30 min,每5 min攪拌一次。4 ℃ 8000 r/min離心10 min,取上清液在420 nm測定吸光度值,以80%乙醇作為空白,測三次取平均值[18]。

褐變度BD=A420×V/m

式(1)

褐變度變化量ΔBH=BD12-BD0

式(2)

式中:A420:測定的吸光度值;V:提取液體積(mL);m為樣品質(zhì)量(g);BD0:第0 d時的褐變度;BD12:第12 d時的褐變度。

1.2.3 過氧化物酶(POD)活力的測定 粗酶液的制備:取2.0 g紫薯樣品,加入預冷的10 mL提取緩沖液(340 mg聚乙二醇 PEG 6000、4 g交聯(lián)聚維酮pvpp、1 mL聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100,用0.1 mol/L pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解定容至100 mL),在冰浴條件下使用勻漿機研磨漿,于4 ℃ 12000 r/min離心30 min,取上清液為酶提取液。

反應體系中含3 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚0.5 mL酶液,加入200 μL 0.5 mol/L H2O2迅速混勻啟動反應,立即開始計時,每隔20 s記錄反應體系在470 nm波長下的吸光值變化,以每分鐘吸光度值變化增加1時所需的酶量為1個活性單位,單位為U/mg prot,酶提取液中蛋白質(zhì)含量利用考馬斯亮藍染色法[19]進行測定。

1.2.4 多酚氧化酶(PPO)活力的測定 粗酶液的制備:稱取1.0 g鮮切紫甘薯樣品,加入10.0 mL的提取緩沖液(0.05 mol/L pH6.8 磷酸緩沖液),在冰浴條件下研磨成漿,于4 ℃、12000 r/min離心30 min,收集上清液,此為酶提取液。

酶促反應體系是4.0 mL 50 mmol/L pH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液、1.0 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液和100 μL酶提取液,混合后立即開始計時。以蒸餾水為空白參比,在反應15 s時開始記錄反應體系在420 nm處吸光度值,作為初始值,每隔20 s記錄一次,連續(xù)測定,至少記錄6個點。重復三次。以每分鐘吸光度值變化增加1時所需的酶量為1個活性單位,單位是U/mg prot。

1.2.5 MDA含量的測定 參照曹建康等[19]方法測定。

1.2.6 花色苷含量測定 花色苷提取液:取2.00 g紫薯樣品,按1∶20 (m∶v)加入提取液(乙醇∶水∶鹽酸=2∶1∶0.1),勻漿,避光60 ℃浸提60 min,在4 ℃ 3000 r/min離心15 min。

取2 mL提取液分別用pH1.0 鹽酸-氯化鉀緩沖溶液和pH4.5鹽酸-醋酸鈉緩沖溶液稀釋定容至10 mL,靜置90 min。用蒸餾水做對照,分別測定其在530、700 nm處的吸光度值。

ΔA=(A530-A700)pH1.0-(A530-A700)pH4.5

式(3)

花色苷含量(mg/100 g)=(ΔA/εL)×M×V×F/(m×100)

式(4)

式中:ε:矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù),26900 L/mol/cm;M:矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量,449.2 g/mol;V:定容的體積,mL;F:稀釋倍數(shù);m:樣品質(zhì)量,g;L:比色皿的寬度,1 cm。

1.2.7 總酚含量 總酚提取液:取2.00 g紫薯樣品,按1∶20 (m∶v)加入提取液(乙醇∶水∶鹽酸=2∶1∶0.1),勻漿,避光60 ℃浸提60 min,在4 ℃ 3000 r/min離心15 min。

標準曲線制作:將1 mg/mL沒食子酸母液稀釋成0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液,分別吸取該溶液0.0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL的比色管中,加蒸餾水定容至1 mL搖勻后加入0.5 mL福林酚試劑(2 mol/L),暗處放置5 min后加入2 mL 20%(w/v)的Na2CO3溶液,加蒸餾水補足25 mL,搖勻,室溫避光反應1 h,于760 nm處測定吸光度。沒食子酸濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,得到線性方程y=2.2501x+0.0052,相關(guān)系數(shù)R2=0. 9991。

樣品中總酚含量測定:取一定量提取液于比色管中,其余測定方法同標準曲線制作,用沒食子酸作標準曲線計算含量,單位為mg/100 g。

1.2.8 酚類提取物紫外-可見光掃描 取新鮮紫甘薯樣品5.00 g,按1∶8 (m∶v)加入甲醇,進行勻漿,放置于-20 ℃冰箱中提取24 h,將勻漿在4 ℃,9000 r/min條件下離心20 min,取上清液在200～400 nm下進行掃描。

1.2.9 HPLC測定酚類組成成分 1 mg/mL的標準儲備液:準確稱取標準品沒食子酸、綠原酸、兒茶酚、焦性沒食子酸、叔丁基對苯二酚、L-苯丙氨酸、愈創(chuàng)木酚、咖啡酸、蘆丁和阿魏酸各1 mg,用甲醇溶液溶解并定容在1 mL棕色容量瓶中。綠原酸標準曲線方程為y=12053x-56810,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9969?？Х人針藴是€方程為y=24810x-30100,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9992。阿魏酸標準曲線方程為y=26251x-51428,相關(guān)系數(shù)R2=0.9988。

樣品液:取鮮切紫甘薯甲醇提取液,用氮氣吹干再用甲醇定容至1 mL。

液相色譜條件[20]:色譜柱:C18,250×4.6 mmI.D;流動相:A:0.05%甲酸水溶液,B:乙腈,梯度洗脫程序見表1,流速0.6 mL/min;進樣量:10 μL;檢測器:SPD-20A紫外檢測器;檢測波長:280 nm;溫度:35 ℃。

表1 流動相洗脫程序Table 1 Mobile phase elution procedures

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計3次重復試驗的標準誤差,采用統(tǒng)計軟件SPSS 22對數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA),采用Duncan多重比較法對各處理平均數(shù)進行差異顯著性分析,差異顯著水平α=0.05,極顯著水平α=0.01,作圖采用Origin Pro 9.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮切紫甘薯貯藏期間褐變度的變化

由圖1可知,兩種貯藏溫度下的鮮切紫甘薯褐變度均呈現(xiàn)上升趨勢。到第12 d時,4 ℃貯藏下的鮮切紫甘薯的褐變度為2.740,而貯藏溫度在12 ℃的鮮切紫甘薯的褐變度為3.994,這說明,在不同溫度下貯藏的鮮切紫甘薯均會發(fā)生褐變,12 ℃貯藏下鮮切紫甘薯褐變程度顯著高于4 ℃貯藏條件下(P<0.05)。

圖1 貯藏溫度對鮮切紫甘薯褐變度的影響Fig.1 Effect of storage temperatureon browning degree of fresh-cut purple sweet potato注:小寫字母不同表示相同貯藏時間不同溫度差異顯著(P<0.05);圖2～圖4、圖9同。

2.2 鮮切紫甘薯貯藏期間POD的變化

過氧化物酶(POD)與衰老相關(guān),其活性能間接說明細胞內(nèi)的過氧化作用的高低,當有H2O2存在時,POD可氧化類黃酮、酚類物質(zhì),使其聚合成褐色物質(zhì),影響鮮切產(chǎn)品的感官[21]。在貯藏期間內(nèi),POD 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在第6 d時出現(xiàn)峰值,這與程雙[22]的研究結(jié)果一致。貯藏前期POD活性的上升可能是由于前期的機械損傷刺激了過氧化物酶對紫甘薯的保護作用,同時可能還會產(chǎn)生POD同工酶。并且POD催化了H2O2氧化酚類物質(zhì),加速了褐變;后期的下降可能是由于傷害對POD產(chǎn)生的作用隨時間減小造成的[23]。貯藏期間4 ℃貯藏組POD活性明顯低于12 ℃貯藏組,4 ℃貯藏組貯藏期間的POD活性的最大峰值為79.01 U/mg prot,12 ℃在第6 d的最大峰值為173.2U/mg prot。不同貯藏溫度下,鮮切紫甘薯POD 活性顯著不同(P<0.05),POD活性越高,鮮切紫甘薯褐變越嚴重。

圖2 貯藏溫度對鮮切紫甘薯POD的影響Fig.2 Effect of storage temperatureon POD of fresh-cut purple sweet potato

2.3 鮮切紫甘薯貯藏期間PPO的變化

多酚氧化酶(PPO)是植物體內(nèi)普遍存在的一種末端氧化還原酶[24-25]。其是使鮮切產(chǎn)品發(fā)生酶促褐變的主要酶類,多以潛伏的狀態(tài)存在,當果蔬組織受到破壞后,PPO被激活,使酚類物質(zhì)被氧化為醌,醌類物質(zhì)聚合導致鮮切產(chǎn)品的褐變[26]。PPO是鮮切紫甘薯發(fā)生酶促褐變的主要酶類之一。當鮮切紫甘薯受到逆境及損傷后,切割會誘導植物組織中潛伏存在的PPO活性,使其活性迅速提高。由圖3可知,在整個貯藏期間,多酚氧化酶一直呈現(xiàn)上升趨勢,前4 d上升趨勢明顯,可能是由于切分導致空間隔離被打破,原本存在于液泡中的酚類物質(zhì)出來與PPO結(jié)合,增加了PPO的活性,后期可能由于褐變底物的累積對PPO有一定的抑制作用,PPO活性趨于平穩(wěn)。多酚氧化酶的活力與鮮切紫甘薯的褐變程度呈正相關(guān)[26]。PPO活性越高,鮮切紫甘薯越容易發(fā)生褐變,進而影響鮮切產(chǎn)品的價值。

圖3 貯藏溫度對鮮切紫甘薯PPO活性的影響Fig.3 Effect of storage temperatureon PPO of fresh-cut purple sweet potato

2.4 鮮切紫甘薯貯藏期間MDA含量的變化

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一,其含量的高低可以表示果蔬膜系統(tǒng)的損害情況[27-28],是評價鮮切產(chǎn)品腐爛情況的重要指標。由于切割導致細胞膜的脂過氧化程度會隨著貯藏時間的延長而積累[29],所以鮮切紫甘薯的MDA含量隨著貯藏時間的增長而增加。由圖4可以看出在鮮切紫甘薯的貯藏期間,MDA含量一直呈現(xiàn)上升趨勢。12 ℃貯藏組在0～6 d時MDA含量的上升速度較快,而后逐漸趨于平緩。在整個貯藏過程中,4 ℃保存的鮮切紫甘薯組的MDA含量顯著低于12 ℃貯藏組(P<0.05),MDA含量越高,膜脂過氧化程度越大,鮮切紫甘薯褐變越嚴重。

圖4 貯藏溫度對鮮切紫甘薯MDA含量的影響Fig.4 Effect of storage temperature on MDA content offresh-cut purple sweet potato

2.5 鮮切紫甘薯貯藏期間花色苷含量的變化

花色苷是紫甘薯的主要營養(yǎng)成分,是引起鮮切紫甘薯外觀顏色改變的重要原因之一。由圖5可知,花色苷含量在整個貯藏過程中呈現(xiàn)顯著下降的趨勢,第4 d之后,12 ℃貯藏的鮮切紫甘薯花色苷含量下降趨勢明顯高于4 ℃。貯藏到第12 d時,4 ℃的鮮切紫甘薯花色苷含量為第0 d時的88.08%,12 ℃貯藏的鮮切紫甘薯花色苷含量為第0 d時的78.53%。貯藏溫度較高組,褐變程度更嚴重,同時花色苷含量也降低的更多。

圖5 貯藏溫度對鮮切紫甘薯花色苷含量的影響Fig.5 Effect of storage temperature on anthocyaninscontent of fresh-cut purple sweet potato注:**表示與第0 d的花色苷含量相比差異極顯著;P<0.01;圖6同。

2.6 鮮切紫甘薯貯藏期間總酚含量的變化

圖6 貯藏溫度對鮮切紫甘薯總酚含量的影響Fig.6 Effect of storage temperature on total phenoliccontent of fresh-cut purple sweet potato

酚類物質(zhì)在植物體中有重要作用,同時為鮮切果蔬的褐變提供了底物,其含量直接影響鮮切產(chǎn)品的褐變進程。由圖6可知,兩種貯藏溫度下的鮮切紫甘薯總酚含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,貯藏到第2 d時,12 ℃保存下的鮮切紫甘薯的總酚含量有了極顯著的上升(P<0.01),而4 ℃保存下的鮮切紫甘薯則無顯著性變化,貯藏到第6 d時到達峰值。整個貯藏期間,12 ℃貯藏組的總酚含量始終高于4 ℃貯藏組,證明酚類物質(zhì)作為褐變的底物,其含量的多少直接影響了褐變的嚴重程度。

2.7 鮮切紫甘薯貯藏期間褐變底物酚類物質(zhì)的分析

2.7.1 紫甘薯酚類提取物紫外光譜掃描 鮮切紫甘薯的酚類提取物的紫外掃描結(jié)果如圖7,紫甘薯酚類提取物有三個吸收峰,在203 nm處有個主吸收峰,在293、327 nm處有兩個次吸收峰。將此結(jié)果與酚類標準品(表2)進行比對,得出鮮切紫甘薯可能含有的酚類物質(zhì)有沒食子酸、蘆丁、綠原酸、焦性沒食子酸、叔丁基對苯二酚、愈創(chuàng)木酚、咖啡酸和阿魏酸。

圖7 紫甘薯酚類提取物紫外光譜掃描Fig.7 Ultraviolet spectrum scanning of phenolicextracts of fresh-cut purple sweet potato

表2 標樣的紫外吸收峰值與相對保留時間
Table 2 UV absorption peak and relativeretention time of the standards

標準樣品最大吸收波長(nm)相對保留時間(min)沒食子酸218、27312.795蘆丁257、205、35820.770咖啡酸218、32617.733綠原酸220、245、32915.351焦性沒食子酸20411.505(+)兒茶酚280、20715.709叔丁基對苯二酚202、230、29323.739L-苯丙氨酸20923.675愈創(chuàng)木酚202、219、27730.803阿魏酸218、236、32126.905

2.7.2 紫甘薯酚類提取物HPLC結(jié)果 鮮切紫甘薯酚類提取物有三個主要的吸收峰,保留時間分別是15.360、17.757和26.929 min,與表2中的綠原酸、咖啡酸和阿魏酸的保留時間十分接近,說明紫甘薯中主要含有這三種酚類物質(zhì)。

圖8 紫甘薯酚類提取物液相色譜圖Fig.8 HPLC of phenolic extracts of purple sweet potato

從圖9可以得出,鮮切紫甘薯提取液中三種酚類物質(zhì)含量:綠原酸>咖啡酸>阿魏酸。綠原酸含量最高,為主要的酚類物質(zhì)。在整個貯藏期間,綠原酸呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,第4 d時達到峰值,前6 d 12 ℃貯藏組的綠原酸含量上升幅度始終高于4 ℃貯藏組,此時12 ℃貯藏組褐變速度較快,綠原酸可能作為酶促褐變底物參與了酶促褐變反應?？Х人岢尸F(xiàn)先下降后上升的趨勢,第8 d開始呈現(xiàn)上升趨勢,但4 ℃貯藏組和12 ℃貯藏組在貯藏過程中咖啡酸的含量并沒有顯著區(qū)別,咖啡酸可能不作為酶促褐變底物參與酶促褐變反應;貯藏期間阿魏酸呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢,12 ℃貯藏組的阿魏酸含量始終顯著高于4 ℃貯藏組,12 ℃貯藏組褐變速度較快,阿魏酸可能作為酶促褐變底物參與鮮切紫甘薯酶促褐變反應。

圖9 三種酚類物質(zhì)含量的變化Fig.9 Changes in the content of three phenolic substances

2.8 相關(guān)性分析

由表3分析可知,褐變度與PPO、POD無顯著相關(guān)性,與總酚、咖啡酸含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與阿魏酸含量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。這與王兆升[30]的研究結(jié)論相一致。褐變度與PPO、POD無顯著相關(guān)性不能說明褐變與這兩種酶無顯著相關(guān)性,因為褐變度反應了鮮切紫甘薯貯藏過程中褐變物質(zhì)的累積程度,呈一直上升的趨勢,不會隨著酶活力的降低而減少。經(jīng)過進一步對褐變度變化量與PPO、POD及總酚分析發(fā)現(xiàn),ΔBD與PPO、POD、總酚、綠原酸、阿魏酸呈顯著相關(guān)。這一結(jié)果說明,鮮切紫甘薯的褐變主要由PPO和POD催化酚類物質(zhì)的氧化引起,褐變底物可能是綠原酸和阿魏酸。

表3 褐變度、褐變度變化量與PPO、POD及總酚的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients of browning degree andbrowning degree change with PPO,POD and total phenol

注：*表示顯著相關(guān)(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

鮮切紫甘薯由于切分導致細胞膜系統(tǒng)的完整性遭到破壞,底物酚類物質(zhì)與酚酶接觸,當有O2參與時,酚類物質(zhì)被氧化成醌類物質(zhì),進行一系列的反應,最后聚合形成黑、褐色物質(zhì),從而引起鮮切紫甘薯的褐變。本研究中,12 ℃貯藏組的鮮切紫甘薯褐變度始終顯著高于4 ℃貯藏組,而且都呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。通過比較,鮮切紫甘薯褐變主要由PPO和POD協(xié)同作用引起,膜脂過氧化也與褐變有一定的相關(guān)性。褐變底物酚類物質(zhì)為綠原酸和阿魏酸。由于該兩種酚類物質(zhì)的合成積累,PPO和POD活性的上升,加速了褐變進程。通過對鮮切紫甘薯褐變機制的分析,可知通過抑制褐變關(guān)鍵酶PPO和POD活性,或是控制褐變底物酚類物質(zhì)綠原酸和阿魏酸的生成積累來有效控制褐變,為鮮切紫甘薯產(chǎn)品開發(fā)提供支持。