,*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,安徽合肥 230009;2.功能性復(fù)合調(diào)味品安徽省重點(diǎn)實(shí)驗室,安徽界首 236500)

花菇是通過控制香菇生產(chǎn)過程中的生長條件,改變香菇發(fā)育過程,使菌蓋形成褐白相間花紋而形成的品種,是香菇中的上品。目前對花菇的報道主要集中在栽培與孢子選種方面[1],關(guān)于花菇化學(xué)成分與活性的研究不多,僅有一些關(guān)于花菇多糖提取工藝及體外抗氧化活性等的研究[2]。

黃山花菇是生長于黃山地區(qū)的花菇品種,以個大、顏色鮮艷及營養(yǎng)豐富著稱,為黃山地區(qū)有名的旅游特產(chǎn)。研究表明真菌蘑菇的營養(yǎng)價值與其多糖成分緊密相關(guān),真菌多糖已被證明具有抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)免疫力等一系列營養(yǎng)健康價值[3-5]。為了加大促進(jìn)黃山地區(qū)花菇資源開發(fā)利用與地方特色農(nóng)副產(chǎn)品精深加工,本課題組近年來對黃山花菇主要化學(xué)組分多糖進(jìn)行了系列研究,包括黃山花菇多糖的分離純化、多糖的結(jié)構(gòu)表征、多糖的構(gòu)效關(guān)系、多糖的營養(yǎng)作用機(jī)理等[6-8]。

本研究在前期工作基礎(chǔ)上,采用化學(xué)和光譜學(xué)結(jié)合的手段,解析了從黃山花菇中分離獲得的一多糖組分黃山花姑多糖Floral Mushroom Polysaccharide 3-1(FMP3-1)的精細(xì)結(jié)構(gòu),并測試了FMP3-1的免疫活性,為黃山花菇資源的開發(fā)利用提供了新基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃山花菇 由安徽黃山云樂靈芝有限公司提供,使用藥物粉碎機(jī)粉碎成粉末,經(jīng)索氏提取器脫色脫脂烘干后備用;乙醇、三氯甲烷、正丁醇、過氧化氫、氯化鈉、溴化鉀、三氟乙酸、甲醇、硼氫化鈉、乙酸、乙酸酐、吡啶、無水硫酸鈉、氫化鈉、正己烷、碘甲烷、甲酸、甲苯等 均為分析純(AR),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DMEM培養(yǎng)基、噻唑藍(lán) Hyclone公司;中性紅染色液 上海麥克林生化科技有限公司;二甲基亞砜、DEAE-Cellulose、Sephacryl S-300、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、二甲基亞砜、Griess試劑 Sigma-Aldrich公司。

W201B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)有限公司;ST-16R型高速冷凍離心機(jī)、Multiskan Go 1510型酶標(biāo)儀、Nicolet 67型紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司;FD-1A-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司;VNMRS600型核磁共振波譜儀、7980型氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司;ALLINE系列E2695系統(tǒng)高效液相色譜儀 沃特世科技(上海)有限公司;Mco-17AIC型CO2培養(yǎng)箱 日本三洋電機(jī)株式會社;SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 多糖FMP3-1的提取分離純化 黃山花菇粗多糖FMP的提取參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。取200 g黃山花菇粉末,在100 ℃下以1∶35的料液比提取2 h。之后用4層紗布過濾提取液,并收集濾液。經(jīng)離心(8000 r/min,25 ℃,10 min)去除不溶性物以收集上清液,用4倍體積為95%的乙醇醇沉24 h。向沉淀物中加Sevege試劑(三氯甲烷∶正丁醇=1∶5～1∶4),其中Sevege試劑與多糖溶液的體積比為1∶5～1∶4,劇烈搖動20 min。重復(fù)幾次后,在分離漏斗中去除蛋白,減壓蒸發(fā)濃縮上清液(轉(zhuǎn)速為70 r/min,溫度為70 ℃),以去除三氯甲烷。將溶液用過氧化氫脫色3～4 h后,裝入3500 Da透析袋中,用自來水透析3 d,去離子水透析2 d。將透析液于-18 ℃冷凍24 h,于室溫融化后離心(8000 r/min,25 ℃,10 min)除去不溶物。之后將溶液冷凍干燥,得到黃山花菇水提粗多糖(FMP),稱其質(zhì)量記為m(g),多糖得率的計算公式為:

獲得的粗多糖FMP通過DEAE-Cellulose陰離子交換層析柱(1.6 cm×40 cm)進(jìn)行初步分離純化,依次用去離子水,0.1、0.2 mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫,流速為2.5 mL/min,用自動部分收集器收集(4 min/管)0.2 mol/L氯化鈉洗脫液部分,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對其進(jìn)行濃縮(轉(zhuǎn)速為70 r/min,溫度為60 ℃),使其體積減小到原體積的10%,冷凍干燥得到粗多糖FMP3。FMP3進(jìn)一步通過Sephacryl S-300凝膠柱進(jìn)行純化,凝膠柱色譜分離條件為:流動相超純水,流速0.2 mL/min,10 min/管。洗脫組分減壓蒸發(fā)濃縮(轉(zhuǎn)速為70 r/min,溫度為60 ℃)。濃縮液于25 ℃下以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。離心所得的上清液采用截留分子量為3500 Da的透析袋,于去離子水中透析3 d。透析后的溶液經(jīng)冷凍干燥后得到多糖FMP3-1。

1.2.2 分子量測定 稱取10 mg FMP3-1,溶于10 mL去離子水中。將溶液于10000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min,取上清液用0.22 μm濾膜過濾。高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)為Waters E2695系統(tǒng),檢測器為2424蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD),凝膠柱型號為UltrahydrogelTM2000(7.8 mm×300 mm)和UltrahydrogelTM500(7.8 mm×300 mm),兩柱串聯(lián)。流動相為去離子水,流速為0.5 mL/min,試樣體積為20 μL。通過測定Detran系列標(biāo)品葡萄糖的分子量,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 紫外光譜掃描 采用紫外光譜法檢測FMP3-1中的蛋白質(zhì)和核酸含量,稱取10 mg FMP3-1溶于5 mL去離子水中,裝入石英比色皿中,于紫外掃描光譜儀上掃描,掃描波長范圍為190～400 nm。

1.2.4 紅外光譜掃描(FT-IR) 稱取1～2 mg多糖樣品和100～200 mg溴化鉀,將樣品和溴化鉀在研缽中混合研碎,壓片后在Nicolet 67型紅外光譜儀上測定,波數(shù)范圍是4000～500 cm-1。

1.2.5 單糖組成測定 FMP3-1的單糖組成分析采用GC法確定[6,9]。將5 mg多糖樣品放入安培管,加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸后,在120 ℃下水解4 h,水解完成后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干(轉(zhuǎn)速為70 r/min,溫度為70 ℃)。加入1～2 mL甲醇繼續(xù)蒸干,重復(fù)三次除去殘留的三氟乙酸。將完全水解后的樣品溶解在3～4 ml去離子水中,并在室溫下加入30 mg硼氫化鈉還原4 h,用25%乙酸中和溶液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至無水狀態(tài)后,加入3 mL乙酸酐和3 mL吡啶,并使反應(yīng)在100 ℃下反應(yīng)1 h。再加入3～4 mL甲苯進(jìn)行減壓蒸干,重復(fù)數(shù)次以去除吡啶。加入三氯甲烷和去離子水各3 mL進(jìn)行萃取,取有機(jī)層,重復(fù)數(shù)次,加入無水硫酸鈉以除盡水份,離心(10000 r/min,25 ℃,10 min)后取1 mL上清液進(jìn)行GC檢測分析,檢測條件:N2:20 mL/min;H2:30 mL/min;空氣:200 mL/min;柱溫:230 ℃,檢測器溫度:250 ℃;氣化室溫度:280 ℃。

1.2.6 甲基化分析 FMP3-1的糖鏈連接方式采用甲基化法測定[8,10]。在100 mL的燒瓶中加入5 g帶油的氫化鈉,再加入25 mL正己烷。用玻璃棒攪拌后靜置1 h,倒出上清液,得到無油氫化鈉。擰緊橡膠塞,用氮?dú)獯蹈蓺浠c。在通氮?dú)獾倪^程中,加入50 mL二甲基亞砜,于30 ℃下恒溫攪拌24 h,直至溶液變?yōu)樯罹G色,制得SMSM試劑。將FMP3-1放在真空干燥箱中干燥3～4 h(-0.1 MPa,50 ℃)。然后將35 mg干燥后的多糖溶解在5 mL干燥的二甲基亞砜中。然后在氮?dú)庀驴焖偌尤? mL SMSM試劑,混合0.5 h。在避光冷鹽浴條件下,慢慢向混合溶液中加入2 mL碘甲烷。在50 ℃油浴中攪拌1 h后,室溫下攪拌過夜。隨后過量的碘甲烷用氮吹除去?；旌弦河萌ルx子水透析3 d(3500 Da透析袋)后,冷凍干燥得到甲基化多糖。稱重5 mg甲基化多糖,放入10 mL安培管中并加入4 mL 88%甲酸,用酒精噴燈封管。甲基化多糖于100 ℃下解聚6 h,并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干。之后步驟與GC處理相同。用GC-MS技術(shù)對其衍生物進(jìn)行分析。質(zhì)譜條件:掃描方式為 EI 源;離子源溫度設(shè)置為230 ℃;檢測器電壓為1.25 kV;掃描時間為0.5 s。

1.2.7 核磁共振分析 將FMP3-1樣品置于真空干燥箱中干燥過夜,稱取60 mg多糖樣品溶于0.6 mL D2O中,用核磁共振儀對其進(jìn)行1H NMR、13C NMR、HSQC和HMBC波譜分析[8]。

1.2.8 FMP3-1的部分酸水解及GC分析 于10 mL安培管中加入5 mL 0.8 mol/L三氟乙酸和50 mg FMP3-1多糖樣品,密封口后在90 ℃烘箱中進(jìn)行酸水解1 h。反應(yīng)結(jié)束后,減壓蒸干三氟乙酸1 h,壓強(qiáng)為0.1 MPa。所得的水解產(chǎn)物用去離子水透析(3500 Da透析袋)、濃縮(轉(zhuǎn)速為70 r/min,溫度為60 ℃)、冷凍干燥,得到部分酸水解多糖FMP3-1S。FMP3-1S進(jìn)一步進(jìn)行GC分析,檢測條件參照1.2.5。

1.2.9 免疫活性評價 多糖的體外免疫活性實(shí)驗參照文獻(xiàn)[6,11]進(jìn)行。使用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW 264.7。實(shí)驗前,用DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至1.0×105個/mL,取150 μL細(xì)胞液于96孔板中,貼壁培養(yǎng)24 h,分別加入50 μL濃度為20、50、100、200和500 μg/mL的多糖樣品溶液,培養(yǎng)48 h后,分別加入20 μL濃度為5 mg/mL的噻唑藍(lán)試劑,混勻,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,移去上清液,加入200 μL二甲基亞砜,振蕩10 min后用酶標(biāo)儀在570 nm下測定吸光度值。巨噬細(xì)胞NO釋放量和吞噬能力測定是向培養(yǎng)液中分別加入Griess試劑和中性紅染色液,反應(yīng)結(jié)束后在540 nm下測定吸光度值。FMP3-1對細(xì)胞增殖活性的作用采用增殖指數(shù)來表示,增殖指數(shù)=Abssample/Abscontrol。每組實(shí)驗重復(fù)5次以上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以X±SD形式表示,采用Origin 9.1軟件繪制圖表,利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理,*表示差異顯著,P<0.05,**表示差異極顯著,P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 FMP3-1的結(jié)構(gòu)分析

將干燥的黃山花菇粉末經(jīng)索氏提取器脫色脫脂后,經(jīng)熱水浸提獲得粗多糖FMP,多糖得率為6.4%。FMP通過DEAE-Cellulose陰離子交換樹脂進(jìn)行初步純化,收集由0.2 mol/L氯化鈉洗脫的多糖FMP3,FMP3,再通過Sephacryl S-300凝膠柱進(jìn)一步純化,獲得多糖組分FMP3-1。FMP3-1在HPGPC上顯示為均一對稱峰(圖1A),表明其為均一組分,測得平均分子量為5.74×105Da。紫外掃描結(jié)果(圖1B)顯示FMP3-1在260和280 nm處并沒有吸收峰,說明FMP3-1中不含有核酸和蛋白質(zhì)。FMP3-1紅外圖譜(圖1C)顯示了多糖的典型吸收峰[8-9],其中3410和2920 cm-1附近的吸收峰歸功于O-H和C-H鍵的伸縮振動,1415 cm-1的吸收峰為糖環(huán)上C-H變形振動,1045 cm-1附近的吸收峰為C-O或C-O-H的彎曲振動峰,而1720 cm-1處無吸收峰表明多糖FMP3-1不含糖醛酸。

GC圖譜(圖1D)分析表明,FMP3-1由甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)和半乳糖(Gal)三種單糖組成,摩爾比為1.00∶9.23∶0.57。GC分析顯示的高含量葡萄糖組分表明FMP3-1的主鏈結(jié)構(gòu)主要由葡萄糖殘基組成。由于在酸水解中多糖支鏈更容易斷裂,為了推斷FMP3-1的結(jié)構(gòu)特征,對FMP3-1進(jìn)行了部分酸水解實(shí)驗。部分酸水解產(chǎn)物FMP3-1S的GC分析結(jié)果(圖1E)表明FMP3-1S由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成,摩爾比率為1.00∶6.05∶0.49。與FMP3-1比較,葡萄糖和半乳糖占比例明顯降低,表明支鏈含有大量葡萄糖和少量半乳糖殘基。

通過甲基化方法確定多糖FMP3-1的連接方式[10]。甲基化FMP3-1進(jìn)行糖醇乙酸酯反應(yīng) 生成的最終產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析,結(jié)果表明FMP3-1主要含有6種連接方式1-β-D-Glcp、1-β-D-Galp、(1→4)-Glcp、(1→6)-Glcp、(1→3,6)-β-D-Manp和(1→3,6)-β-D-Glcp,各連接方式之間的摩爾比為1.0∶0.49∶1.04∶5.09∶0.84∶0.62。由此可知,FMP3-1是一個帶有分支的雜多糖,而高含量的(1→6)-Glcp是多糖FMP3-1主鏈的主要組成結(jié)構(gòu)。

圖1 FMP3-1的HPGPC圖譜(A)、紫外光譜(B)、FT-IR圖譜(C)、GC圖譜(D)及其水解產(chǎn)物FMP3-1S的GC圖譜(E)Fig.1 HPGPC(A),UV spectrum(B),FT-IR(C),GC(D)of FMP3-1 and GC of its hydrolyzed production FMP3-1S(E)

圖2 FMP3-1的核磁共振譜Fig.2 NMR spectra of FMP3-1注:A：1H NMR;B：13C NMR;C：HSQC;D:HMBC。

為了進(jìn)一步確定FMP3-1化學(xué)結(jié)構(gòu),對其進(jìn)行1H NMR、13C NMR、HSQC、HMBC核磁分析(圖2)。在參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]及結(jié)合單糖組成、甲基化結(jié)果的基礎(chǔ)上,對FMP3-1各糖殘基化學(xué)位移進(jìn)行了歸屬。通過分析,確定(1→4)-Glcp、1-β-D-Glcp、(1→3,6)-β-D-Manp、1-β-D-Galp、(1→3,6)-β-D-Glcp和(1→6)-Glcp各糖殘基的異頭氫碳吸收峰分別為5.24 ppm/102.1 ppm、5.21 ppm/102.3 ppm、4.92 ppm/104.1 ppm、4.82 ppm/100.8 ppm、4.60 ppm/105.3 ppm、4.37 ppm/105.6 ppm。FMP3-1的HMBC譜圖(圖2D)上顯示了糖殘基之間的鏈接位點(diǎn),其中明顯的交叉峰F H1/F C6表明(1→6)-Glcp是FMP3-1中主要的連接方式。結(jié)合GC和甲基化結(jié)果可以推斷,多糖FMP3-1的主鏈由(1→4)-β-D-Glcp、(1→6)-β-D-Glcp和(1→6)-β-D-Manp組成,在(1→6)-β-D-Glcp和(1→6)-β-D-Manp的O-3位連有支鏈1-β-D-Glcp和1-β-D-Galp。由李盛等[15]可知,菌類多糖主要由(1→3)-β-D-Glcp組成,而連接有1→6支鏈的(1→3)-β-D-Glcp能提高機(jī)體免疫功能。Zhou等[16]研究發(fā)現(xiàn),白玉菇堿提多糖WHP的主鏈?zhǔn)怯?1→3)-β-D-Glcp組成,平均3～4個殘基的O-6位連接1-β-D-Glcp,表明白玉菇堿提多糖WHP是一種典型的具有良好免疫活性的菌類多糖。由Huang等[17]可知,靈芝多糖的主鏈?zhǔn)怯?1→3)-β-D-Glcp和(1→4)-β-D-Glcp組成,帶有(1→6)-Glcp的支鏈。根據(jù)Meng等[18]的報道,平菇多糖的主鏈?zhǔn)怯?1→3)-β-D-Glcp組成,可增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖。與上述文獻(xiàn)研究不同的是,本文中從黃山花菇中提取出的多糖FMP3-1是一種雜多糖。

2.2 FMP3-1的免疫活性分析

采用體外免疫活性實(shí)驗檢測了多糖FMP3-1及其水解產(chǎn)物FMP3-1S對巨噬細(xì)胞Raw 264.7的增殖活性、NO分泌能力和吞噬活性的影響,結(jié)果見圖3。由圖3可知,FMP3-1和其水解產(chǎn)物FMP3-1S能明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖(圖3A),且具有濃度效應(yīng),在濃度為500 μg/mL時,增殖指數(shù)分別為1.84和1.41。比較多糖FMP3-1及其水解產(chǎn)物FMP3-1S對巨噬細(xì)胞Raw 264.7增殖的影響可知,部分酸水解多糖FMP3-1S對巨噬細(xì)胞Raw 264.7的增殖活性有明顯的減弱,與FMP3-1相比有差異明顯。由此推斷支鏈的缺失對多糖FMP3-1免疫活性的發(fā)揮具有顯著影響(P<0.05)。研究表明多糖發(fā)揮活性的構(gòu)效關(guān)系十分復(fù)雜,受多糖支鏈、取代度、溶解度、分子量、溶液狀態(tài)等的影響[15]。FMP3-1與FMP3-1S活性的差異驗證了上述論斷。巨噬細(xì)胞Raw 264.7分泌NO能力和吞噬活性實(shí)驗結(jié)果(圖3B、圖3C)表明,FMP3-1與FMP3-1S都能極顯著(P<0.01)促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW 264.7的NO釋放量,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞RAW 264.7的吞噬活性(P<0.01)。研究結(jié)果進(jìn)一步說明了FMP3-1具有很好的免疫促進(jìn)作用。Zhou等[16]研究了白玉菇多糖及其酸水解產(chǎn)物的免疫活性,發(fā)現(xiàn)白玉菇多糖WHP具有較好的細(xì)胞增殖活性,酸水解產(chǎn)物WHPS能顯著提高巨噬細(xì)胞RAW 264.7的吞噬活性、免疫活性。相比于白玉菇多糖,黃山花菇多糖能更好的提高巨噬細(xì)胞RAW 264.7的增殖活性并且能促使巨噬細(xì)胞RAW 264.7分泌更多的NO,這些結(jié)果說明黃山花菇多糖具有更好的免疫活性。由上述結(jié)果可知,菌菇多糖及其酸水解產(chǎn)物免疫活性的差異可能是由于結(jié)構(gòu)差異造成的。

圖3 FMP3-1和FMP3-1S對巨噬細(xì)胞Raw 264.7免疫活性的影響Fig.3 Immunoassay of FMP3-1 and FMP3-1Sin macrophage Raw 264.7注:與對照組相比,*代表差異顯著P<0.05,**代表差異極顯著P<0.01。

3 結(jié)論

采用DEAE-纖維素離子交換層析柱及葡聚糖凝膠色譜技術(shù)成功從黃山花菇水提粗多糖FMP3中分離出一個均一多糖組分FMP3-1,紫外掃描結(jié)果顯示FMP3-1不含核酸和蛋白質(zhì)。FT-IR圖譜分析表明FMP3-1不含糖醛酸,為中性多糖組分。FMP3-1的平均分子量為5.74×105Da,由甘露糖、葡萄糖和半乳糖三種單糖組成,摩爾比為1.00∶9.23∶0.57。甲基化結(jié)果表明FMP3-1含有6種連接方式1-β-D-Glcp、1-β-D-Galp、(1→4)-Glcp、(1→6)-Glcp、(1→3,6)-β-D-Manp和(1→3,6)-β-D-Glcp,各連接方式之間的摩爾比為1.0∶0.49∶1.04∶5.09∶0.84∶0.62,是一個帶有分支的雜多糖。FMP3-1的主鏈由(1→4)-β-D-Glcp、(1→6)-β-D-Glcp和(1→6)-β-D-Manp組成,在(1→6)-β-D-Glcp和(1→6)-β-D-Manp的O-3位連有支鏈1-β-D-Glcp和1-β-D-Galp。免疫活性實(shí)驗結(jié)果表明FMP3-1及其水解產(chǎn)物FMP3-1S都能促進(jìn)巨噬細(xì)胞Raw264.7的增殖,提高巨噬細(xì)胞Raw264.7的NO分泌和吞噬能力,具有很好的免疫活性,但FMP3-1的免疫活性高于FMP3-1S,表明FMP3-1免疫活性受支鏈結(jié)構(gòu)影響較大。