李夢(mèng)寒，王志勇，盛 雪，崔東影，席恩澤，湯夢(mèng)琪，張惠愷，許曉曦,，馬春麗,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150088）

嬰兒時(shí)期腸道菌群尚未完善，免疫系統(tǒng)不夠成熟，腸道、呼吸道等極易被感染。母乳或嬰兒配方奶粉作為嬰兒首先攝入的食物，對(duì)嬰兒的健康產(chǎn)生重要影響[1]。研究發(fā)現(xiàn)，母乳喂養(yǎng)的嬰兒患哮喘、肥胖癥、兒童期白血病、嬰兒猝死綜合征和壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)偏低[2]，這是因?yàn)槟溉橹泻胸S富的生物活性物質(zhì)有助于嬰兒腸道菌群的良好穩(wěn)態(tài)及免疫系統(tǒng)的發(fā)育，如 α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）、母乳低聚糖、分泌的抗體、乳鐵蛋白等。

α-LA是母乳中的生物活性蛋白之一，占總蛋白質(zhì)的20%～25%，在成熟母乳中的質(zhì)量濃度為（2.44±0.64）g/L[3]。 它能為嬰兒提供豐富的必需氨基酸，如色氨酸和半胱氨酸[4]，并促進(jìn)礦物質(zhì)吸收[5]；參與乳糖合成以促進(jìn)乳的分泌[6]；其熔球狀態(tài)能抗病毒感染并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[6]。在α-LA消化過程中，會(huì)生成各種生物活性肽，其中一些生物活性肽具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抑制血壓升高等 活性[7]，更重要的是，已有報(bào)道表明在α-LA體外消化過程中產(chǎn)生抗菌肽和刺激雙歧桿菌生長(zhǎng)的肽鏈，它們很有可能作用于腸道細(xì)菌并調(diào)整腸道菌群保持動(dòng)態(tài)平衡，從而進(jìn)一步影響嬰兒的免疫系統(tǒng)與生長(zhǎng)發(fā)育[8]。因?yàn)槟c道菌群的紊亂不但與哮喘、濕疹、小兒肥胖、壞死性小腸結(jié)腸炎等嬰幼兒疾病相關(guān)[9]，還有可能影響成年后炎性腸病、腸易激綜合征、心血管疾病[10]、精神疾病[11]、I型糖尿病，甚至是癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[12]。

嬰兒配方奶粉是在牛乳的基礎(chǔ)上，調(diào)整和強(qiáng)化蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營(yíng)養(yǎng)素加工而成的，并且在設(shè)計(jì)上要盡可能接近母乳[13]。牛乳和母乳中乳清蛋白的構(gòu)成不同，母乳中的乳清蛋白以α-LA為主，而牛乳中以β-乳球蛋白為主，并且這種蛋白不存在于母乳中。這就導(dǎo)致嬰兒配方奶粉中添加了母乳中不存在的β-乳球蛋白，而主要的α-LA相對(duì)缺乏[14]。α-LA作為母乳中重要的免疫蛋白，除了能為嬰兒提供必需氨基酸等各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還可能具有調(diào)整腸道菌群的作用，可幫助腸道有益菌快速穩(wěn)定地定植在嬰兒腸道中，減少有害菌的黏附繁殖，它們的定植有助于嬰幼兒先天免疫系統(tǒng)的形成。所以，在嬰兒配方奶粉中補(bǔ)充α-LA對(duì)于嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育意義重大。然而，添加過少的α-LA可能不能對(duì)嬰兒的腸道菌群起到調(diào)整的作用，添加過多的蛋白質(zhì)則會(huì)增加?jì)雰旱牡?fù)荷，造成腎臟負(fù)擔(dān)[15]。因此，探究α-LA在嬰兒配方奶粉中的適宜添加量，在保證其最大程度的發(fā)揮生物活性的同時(shí)減少用量，意義十分重大。

在前期體外實(shí)驗(yàn)中，探究不同添加量的α-LA對(duì)腸道益生菌和有害菌的增殖或抑制作用，以此為基礎(chǔ)，參考母乳中α-LA添加量，本實(shí)驗(yàn)再次篩選出高添加量α-LA（200 mg/kg）、中添加量α-LA（100 mg/kg）、低添加量α-LA（20 mg/kg）3 個(gè)劑量，以SD大鼠為動(dòng)物模型，采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)探討α-LA對(duì)腸道菌群多樣性及物種組成的影響，重點(diǎn)分析不同添加量α-LA對(duì)腸道益生菌、潛在有害菌的促進(jìn)或抑制作用，從而選擇出調(diào)節(jié)嬰兒腸道菌群的最佳添加量，為進(jìn)一步的嬰兒喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)，最終為嬰兒配方奶粉中α-LA科學(xué)的添加量提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

α-LA（WPC-8800） 美國(guó)Hilmar Ingredients公司。

實(shí)驗(yàn)選用4 周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量150 g左右，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。許可證號(hào)：SPF級(jí) 90～110 g SCXK（京）2016-0026。飼養(yǎng)期間給予自由采食和飲水。維持室內(nèi)溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度40%～70%、12 h晝夜循環(huán)采光。飼養(yǎng)大鼠所用的鼠籠、飲用水瓶等用具均用稀釋后的84消毒液浸泡30 min后，用自來水清洗干凈、自然晾干。飲用水經(jīng)高壓滅菌后自然降至室溫供大鼠飲用。墊料每隔3～4 d更換一次，其他操作嚴(yán)格遵守鼠房規(guī)范。

1.2 儀器與設(shè)備

DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；BPG-9070A鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限 公司；BSA224S分析天平 德國(guó)Sartorius公司；MX-S可調(diào)式混勻儀 美國(guó)Scilogex公司；VD-1320型無(wú)菌操 作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造廠；DW-86L490J型 -80 ℃超低溫冰箱 青島海爾集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 分組及取樣

大鼠適應(yīng)3 d后正式開始實(shí)驗(yàn)，40 只大鼠隨機(jī)分為4 組，對(duì)照組（A組）、高添加量組（B組）、中添加量組（C組）、低添加量組（D組），每組各10 只大鼠。A、B、C、D四組大鼠分別灌喂0.5 mL的生理鹽水，200、100、20 mg/kg的α-LA。每天灌喂時(shí)間固定，灌喂持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期28 d。

分別于實(shí)驗(yàn)的第14、28天每組隨機(jī)選取3 只大鼠，心臟取血。轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖，使用75%的乙醇溶液擦拭大鼠腹部，消毒后的手術(shù)剪打開大鼠腹腔將腸道完整分離出來，在結(jié)腸末端取1～2 顆大鼠糞便保存于滅菌后的EP管中，液氮速凍后在-80 ℃冰箱保存。樣本分組情況如表1所示。

表 1 樣品分組表Table 1 Grouping of experimental rats

1.3.2 大鼠腸道菌群分析

1.3.2.1 大鼠糞便測(cè)序?qū)嶒?yàn)過程

大鼠糞便樣品從-80 ℃冰箱取出后立刻放入干冰內(nèi)寄送到北京奧維森基因科技有限公司，然后進(jìn)行如下測(cè)序?qū)嶒?yàn)過程：首先用糞便組基因DNA提取試劑盒提取大鼠糞便DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。選擇擴(kuò)增16S rRNA基因的V3-V4區(qū)域，合成帶有錯(cuò)位堿基的融合引物。同時(shí)保證樣本的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)一致，使絕大多數(shù)樣本能夠擴(kuò)增出濃度合適的產(chǎn)物。混合同一樣本的3 份PCR產(chǎn)物后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，再用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。使用酶標(biāo)儀對(duì)PCR產(chǎn)物檢測(cè)定量，并進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。構(gòu)建MiSeq PE文庫(kù)后采用Illumina Miseq PE 300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.2.2 生物學(xué)信息分析

Miseq測(cè)序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，下機(jī)數(shù)據(jù)PE reads去除barcode和primer拼接后得到raw tags，raw tags經(jīng)進(jìn)一步去除嵌合體、短序列后得到優(yōu)質(zhì)序列clean tags。在0.97相似度下利用qiime（v1.8.0）軟件進(jìn)行可分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種注釋。將OTU代表序列與相應(yīng)的微生物數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到每個(gè)樣本的物種分類信息，并在各個(gè)水平上注釋。一方面，基于聚類結(jié)果，進(jìn)行α多樣性分析和β多樣性分析；另一方面，基于注釋結(jié)果，可以得到各水平的物種組成信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

α多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)使用Statistix 8進(jìn)行顯著性分析后用OriginPro 8.5.1軟件作圖，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠腸道菌群多樣性分析

2.1.1 α多樣性分析

在微生物擴(kuò)增子測(cè)序中，α多樣性分析了樣品中兩個(gè)因素，豐富度（物種類別的多樣性）和均勻度（物種組成多少的整體分布）[16]，本實(shí)驗(yàn)以稀釋性曲線、物種數(shù)目飽和度曲線、α多樣性指數(shù)3 個(gè)角度評(píng)估α多樣性。

稀釋性曲線是基于OTU聚類結(jié)果利用mothur做稀釋性分析，利用R語(yǔ)言工具制作的曲線圖。它可以用來評(píng)估樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理，也可以用來比較不同樣本的物種豐富度[17]。由圖1可知，大鼠腸道菌群的稀釋曲線隨樣品序列數(shù)目增加趨于平坦，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，測(cè)序結(jié)果可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。在測(cè)序深度相同的情況下，B4、B6、C5、B5、C4的豐富度明顯高于其他樣品，說明第28天時(shí)高添加量組、中添加量組提高了大鼠菌群的豐富度。

物種數(shù)目飽和度曲線也是分析樣本中微生物多樣性的一種方法，它可以從物種豐富度和物種均勻度兩個(gè)方面解釋多樣性[18]。由圖2可知，24 個(gè)樣品的曲線趨勢(shì)相似。在水平方向上，各樣品曲線寬度反映豐富度，曲線在橫軸上的范圍較大，體現(xiàn)出不同樣品的物種豐度可能有較大差異，其中B4、B5豐富度最高，A2、A3豐富度最低。另一方面，曲線形狀反映了樣本中物種的均勻度，圖中各個(gè)樣品曲線平滑程度較好，僅末端有部分曲折，整體趨勢(shì)平緩，說明物種分布均勻。

圖 1 基于OTU總數(shù)的稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves

圖 2 基于OTU總數(shù)的物種數(shù)目飽和度曲線Fig. 2 Rank abundance curves

α多樣性指數(shù)包括一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)，通過單樣品的多樣性分析可以反映微生物群落的豐富度和均勻度。本實(shí)驗(yàn)采用Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、PD whole tree指數(shù)評(píng)估各樣本的α多樣性，進(jìn)而分析各實(shí)驗(yàn)組的多樣性。Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)評(píng)價(jià)物種豐富度，數(shù)值越大豐富度越高；Shannon指數(shù)、PD whole tree指數(shù)均可基于豐富度和均勻度兩個(gè)方面評(píng)價(jià)多樣性，數(shù)值越大說明該環(huán)境的物種越豐富，同時(shí)各物種分配越均勻。

圖 3 基于OTU總數(shù)的α多樣性指數(shù)圖Fig. 3 α-Diversity indexes based on the total number of OTUs

由圖3可知，Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、PD whole tree指數(shù)變化趨勢(shì)相似。在大鼠飼喂第14天時(shí)，各多樣性指數(shù)柱形圖幾乎持平，不同添加量的蛋白對(duì)提高大鼠糞便菌群α多樣性效果不顯著 （P＞0.05）；飼喂第28天時(shí)，高添加量組、中添加量組各多樣性指數(shù)均高于對(duì)照組，在Shannon指數(shù)中，高添加量組多樣性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。低添加量組多樣性與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。說明第14天時(shí)各蛋白濃度組不能提高菌群多樣性，第28天時(shí)高添加量、中添加量蛋白發(fā)揮出生物活性，顯著提高了大鼠腸道菌群的豐富度和均勻度。

2.1.2 β多樣性分析

β多樣性主要分析了樣本與樣本間微生物群落組成的相似性[19]。NMDS法是評(píng)估β多樣性的方式之一，它以點(diǎn)的形式將樣本包含的物種信息反映在多維空間上，通過點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離體現(xiàn)樣本間的差異程度[20]。由圖4可以看出，在大鼠飼養(yǎng)第14天時(shí)，每組內(nèi)各個(gè)樣品點(diǎn)分布區(qū)域比較密集，樣品個(gè)體差異性較小，每組內(nèi)3 個(gè)樣品微生物群落結(jié)構(gòu)相似，平行度較好。AA、BA、CA、DA各組形成的圓圈兩兩均有交集，說明組間差異性較小，此時(shí)不同添加量的α-LA對(duì)腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。飼養(yǎng)第28天時(shí)，AB、DB兩組所形成的圓圈面積小，樣品平行度好，BB組、CB組稍差，這可能與大鼠的個(gè)體差異相關(guān)。第28天時(shí)各組的圓圈交集較少，群落組成出現(xiàn)差距，此時(shí)α-LA發(fā)揮出了生物活性，對(duì)腸道菌群群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組區(qū)分顯著。

圖 4 大鼠腸道菌群NMDS分析圖Fig. 4 NMDS analysis of rat intestinal flora

綜合α多樣性和β多樣性分析可知，本實(shí)驗(yàn)測(cè)序量足夠大，結(jié)果可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。在大鼠飼喂第14天時(shí)，各組AA、BA、CA、DA在豐富度、均勻度、群落結(jié)構(gòu)上均無(wú)顯著差異，此時(shí)各蛋白添加量組并未完全發(fā)揮生物活性；在飼喂第28天時(shí)，BB （P＜0.05）、CB（P＞0.05）組的多樣性明顯提高，群落結(jié)構(gòu)與對(duì)照組AA組相比差距很大，此時(shí)α-LA完全發(fā)揮出了生物活性，它對(duì)于腸道菌群的調(diào)整是一個(gè)溫和的漸進(jìn)過程。王瑞[21]分析了不同月齡嬰幼兒腸道菌群OTU數(shù)量及α多樣性。D1W為0～6 月齡嬰兒樣品；D2W為6～12 月齡較大嬰兒樣品；D3W為12～36 月齡幼兒樣品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)D1W樣品OTU數(shù)量和豐富度均顯著低于D2W、D3W（P＜0.05），而D2W、D3W的Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。由此可推測(cè)6～12 月是嬰兒腸道菌群繁衍的關(guān)鍵時(shí)期，在此時(shí)期長(zhǎng)時(shí)間補(bǔ)充高添加量α-LA、中添加量α-LA可更好的提高嬰兒腸道菌群多樣性，調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)更多種類的益生菌在腸道內(nèi)定植繁衍，減少腸道有害菌的黏附占位，使嬰兒腸道菌群健康發(fā)展。

2.2 物種組成分析

2.2.1 基于門分類水平的分析

經(jīng)物種組成分析可得知一個(gè)或多個(gè)樣本在各分類水平上的分類學(xué)比對(duì)情況。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，能觀測(cè)樣本在門、綱、目、科、屬5 個(gè)水平的群落結(jié)構(gòu)[16]。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)分析了門水平和屬水平。

探究不同添加量的α-LA對(duì)門水平上腸道菌群組成的影響，結(jié)合圖5可知，各組樣本生成的OTU主要由5 個(gè)門構(gòu)成：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia），其中厚壁菌門和擬桿菌門占絕對(duì)主導(dǎo)地位。此外，由圖6可以看出，其他相對(duì)豐度較高的門還有柔膜菌門（Tenericutes）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria）等。第28天時(shí)BB、CB組出現(xiàn)了浮霉菌門（Planctomycetes）、綠 灣 菌 門（ C h i o r o f l e x i ） 、 芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadetes）、醋酐菌門（Acidobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）等新菌門，說明高添加量α-LA和中添加量α-LA在第28天時(shí)有效提高了大鼠腸道菌群的多樣性，與上述α多樣性分析相符合。

圖 5 大鼠腸道菌群門水平物種組成分析柱狀圖Fig. 5 Analysis of intestinal flora composition at the phylum level

補(bǔ)充不同添加量的α-LA會(huì)影響大鼠門水平上腸道菌群組成，且隨時(shí)間變化，如圖6所示：第14天時(shí)，相比于對(duì)照組，各添加量蛋白組提高了放線菌門的相對(duì)豐度，蛋白添加量由高到低分別提高0.49%、0.49%、1.44%；BA組降低了厚壁菌門豐度并提高擬桿菌門相對(duì)豐度，CA、DA組對(duì)厚壁菌門、擬桿菌門整體影響不大。第28天時(shí)，隨α-LA添加量提高，厚壁菌門相對(duì)豐度不斷提高，同時(shí)擬桿菌門、變形菌門相對(duì)豐度不斷下降。高添加量BB組、中添加量CB組、低添加量DB組分別使擬桿菌門下降9.49%、20.61%、27.88%，使變形菌門分別下降0.9%、1.8%、2.08%，使厚壁菌門分別提高5.46%、18.97%、25.88%。不同蛋白添加量組對(duì)放線菌門相對(duì)豐度均有不同水平的提高，對(duì)疣微菌門影響不顯著。拉姆卓嘎[22]探究了嬰兒在不同喂養(yǎng)方式下對(duì)腸道菌群的影響，研究發(fā)現(xiàn)母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道菌群呈動(dòng)態(tài)變化：從出生后的14 d～4 個(gè)月這段期間，厚壁菌門相對(duì)豐度從33.3%增至53.4%；變形菌門從53.4%下降至17.5%，放線菌門從8.6%增至27.3%。這個(gè)趨勢(shì)與大鼠腸道菌群在28 d時(shí)的變化十分相似，由此可以推測(cè)，母乳中的α-LA對(duì)腸道菌群門水平的影響十分顯著。

圖 6 大鼠腸道菌群門水平熱圖Fig. 6 Heatmap of the intestinal flora at the phylum level

2.2.2 基于屬分類水平的分析

圖 7 大鼠腸道菌群屬水平熱圖Fig. 7 Heatmap of the intestinal flora at the genus level

由圖7可知，乳桿菌（Lactobacillus）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）下的未知屬Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcaceae_UCG-005、Ruminococcus_1、阿克曼氏菌（Akkermansia）、木質(zhì)真菌（Eubacterium xylanophilumgroup）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）下的未知屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnospiraceae_UCG-006、Marvinbryantia、布勞特氏菌（Blautia）、梭菌科下的未知屬Clostridium sensu stricto_1、普氏菌科（Prevotellaceae）下的未知屬（Prevotella_9、Prevotella_1、Prevotellaceae_UCG-001）、擬桿菌（Bacteroides）等為大鼠腸道中相對(duì)豐度較高的菌屬。比較第14天與第28天時(shí)的熱圖發(fā)現(xiàn)，第14天時(shí)各樣本微生物主要分布在特定的幾種屬上，其余屬分布豐度較低，而第28天時(shí)大量屬的豐度均有提高，樣本分布均勻度提高，這再次印證了上述α多樣性分析。

由圖8可知，灌喂α-LA會(huì)影響大鼠腸道菌群屬水平上的組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第28天時(shí)中添加量、低添加量蛋白使乳桿菌相對(duì)豐度分別提高9.89%、26.29%，而高添加量蛋白使其豐度下降3.29%。乳桿菌是一種優(yōu)質(zhì)的益生菌，已有大量文獻(xiàn)資料表明其促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖、參與調(diào)解結(jié)腸粘液層、重塑黏蛋白糖基化等功能[23]。第28天時(shí)蛋白添加量由高到低分別使木質(zhì)真菌相對(duì)豐度提高0.31%、0.18%、0.45%；高添加量蛋白降低布勞特氏菌的相對(duì)豐度，而中、低添加量蛋白維持或提高其相對(duì)豐度；各蛋白添加量組均能維持毛螺旋菌科成員Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnospiraceae_UCG-006、Marvinbryantia以及梭菌科下的未知屬Clostridium sensu stricto_1相對(duì)豐度保持恒定。毛螺旋菌科能將復(fù)雜的多糖降解為乙酸、丁酸和丙酸[24]，布勞特氏菌是醋酸鹽生產(chǎn)者、木質(zhì)真菌、梭菌科下的未知屬Clostridium sensu stricto_1是丁酸鹽生 產(chǎn)者[25]，這些短鏈脂肪酸被胃腸道中的上皮細(xì)胞迅速吸收，參與細(xì)胞的調(diào)節(jié)過程，如基因表達(dá)、趨化性、分化、增殖和凋亡[26]。此外，短鏈脂肪酸還能影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[27]。第14天時(shí)高添加量蛋白降低阿克曼氏菌的相對(duì)豐度，中、低添加量蛋白對(duì)其有一定的促進(jìn)作用。對(duì)于瘤胃球菌科成員Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcaceae_UCG-005、Ruminococcus_1，各蛋白組有維持其相對(duì)豐度的趨勢(shì)。阿克曼氏菌是新興的益生菌，具有改善糖尿病大鼠的肝功能、減少糖毒性和脂毒性、緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥、恢復(fù)正常的腸道菌群等功能[28]。瘤胃球菌科成員可抑制霍亂弧菌感染，移植到發(fā)育不良的小鼠體內(nèi)可改善其生長(zhǎng)和代謝異常[29]。阿克曼氏菌和瘤胃球菌科在長(zhǎng)壽老人糞菌中相對(duì)豐度均較高，可能成為長(zhǎng)壽信號(hào)之一[30]。

圖 8 大鼠腸道菌群屬水平物種組成分析柱狀圖Fig. 8 Analysis of intestinal flora composition at the genus level

此外，α-LA可降低普氏菌科成員相對(duì)豐度，蛋白添加量由高到低分別使普氏菌科下的未知菌屬Prevotella_9豐度下降2.01%、2.26%、2.3%；使普氏菌科下的未知菌屬Prevotellaceae_UCG-001相對(duì)豐度下降3.89%、3.97%、4.26%。普氏菌科豐度會(huì)在早期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)增加，并被證明參與了關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制[31]；由于它是負(fù)責(zé)支鏈氨基酸生物合成和胰島素抵抗的主要物種，因此也與缺血性心血管疾病和2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[32]。α-LA呈濃度依賴的趨勢(shì)降低了擬桿菌屬相對(duì)豐度，蛋白添加量由高到低分別使其豐度分別下降3.33%、4.78%、6.68%。研究表明，擬桿菌屬的細(xì)胞表面脂蛋白BtuG2與VB12的親和度高于內(nèi)源因子，因此其豐度提高可能導(dǎo)致VB12缺乏[33]；該物種與多種疾病相關(guān)，包括結(jié)腸直腸癌、肝病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[34]。除此之外，α-LA對(duì)大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）體現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制作用，中添加量蛋白組抑制效果最好，將其相對(duì)豐度由1.90%降至0.01%。

嬰兒腸道菌群的定植是一個(gè)連續(xù)而復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程。有研究報(bào)道，嬰兒期是腸道菌群定植的最佳時(shí)期，到1 歲時(shí)腸道內(nèi)微生物接近于成人，屬于相對(duì)成熟及穩(wěn)定期[35]。不同喂養(yǎng)方式對(duì)嬰兒腸道菌群的影響產(chǎn)生較大差異，母乳喂養(yǎng)能提高嬰兒腸道中雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、韋榮球菌科（Veronococcidae）、毛螺旋菌科、永榮氏球菌屬（Veillonella）等腸道益生菌的相對(duì)豐度，同時(shí)降低大腸桿菌-志賀菌屬、克雷白桿菌屬（Klebsiella）等腸道有害菌的相對(duì)豐度[36]。母乳喂養(yǎng)兒腸道優(yōu)勢(shì)益生菌的維持時(shí)間長(zhǎng)，促進(jìn)了菌群穩(wěn)態(tài)的建立。

在本實(shí)驗(yàn)中，不同添加量的α-LA起到了與母乳相似的作用，它同樣促進(jìn)腸道優(yōu)勢(shì)益生菌的繁殖，并抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)。從益生菌的角度分析，中、低蛋白組提高了益生菌乳桿菌、布魯克士菌、阿克曼士菌相對(duì)豐度，而高添加量蛋白組作用相反；高、中、低蛋白組均能提高木質(zhì)真菌并維持瘤胃球菌科成員、毛螺旋菌科成員、梭菌科下的未知屬Clostridium sensu stricto_1相對(duì)豐度保持恒定。從有害菌角度分析，α-LA使普氏菌科成員、擬桿菌屬相對(duì)豐度有不同程度的降低，作用效果隨濃度降低而提高；對(duì)有害菌大腸桿菌-志賀菌屬體現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制作用，中添加量組抑制效果最好，將其相對(duì)豐度由1.90%降至0.01%。由此可知，不同添加量的α-LA均能維持或促進(jìn)腸道益生菌繁殖，中、低添加量蛋白效果更好；對(duì)腸道中潛在有害菌起到抑制作用，高、中添加量蛋白效果更好。

3 結(jié) 論

經(jīng)實(shí)驗(yàn)探究，中添加量α-LA（100 mg/kg）為調(diào)節(jié)腸道菌群的最佳添加量，主要實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下：1）第14天時(shí)不同添加量的α-LA對(duì)大鼠腸道菌群的多樣性無(wú)明顯影響，第28天時(shí)高添加量蛋白組、中添加量蛋白組在提高物種多樣性的同時(shí)兼顧了均勻性。第14天時(shí)各濃度組聚集成團(tuán)，交叉區(qū)域范圍廣，區(qū)分不明顯；第28天時(shí)各組圓圈交集較少，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組區(qū)分顯著，蛋白對(duì)群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。大鼠腸道菌群以厚壁菌門和擬桿菌門為主，各濃度蛋白組對(duì)于門水平的調(diào)節(jié)與母乳相似。中、低蛋白組能提高乳桿菌、布勞特氏菌、阿克曼氏菌的相對(duì)豐度；各濃度組均能使普氏菌科成員、擬桿菌相對(duì)豐度有不同程度的降低，作用效果隨濃度降低而提高；各濃度組均能提高木質(zhì)真菌相對(duì)豐度并維持瘤胃球菌科成員、毛螺旋菌科成員、梭菌科下的未知屬相對(duì)豐度保持恒定。2）中添加量α-LA能在提高菌群多樣性的同時(shí)溫和的提高益生菌相對(duì)豐度，降低潛在有害菌的相對(duì)豐度，有利于長(zhǎng)期維持腸道的健康。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為嬰兒喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)提供參考值，最終為嬰兒配方奶粉中α-LA科學(xué)的添加量提供理論支持。