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        復(fù)合膜固定化酶提高米糠穩(wěn)定性

        2020-04-02 03:32:26于殿宇陳書曼唐洪琳秦蘭霞
        食品科學(xué) 2020年6期
        關(guān)鍵詞:米糠復(fù)合膜脂肪酶

        于殿宇,陳書曼,王 彤,李 丹,張 雪,吳 楠,唐洪琳,秦蘭霞,,姚 凱

        (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.湖北天星糧油股份有限公司,湖北 隨州 441300)

        米糠是稻谷加工中主要副產(chǎn)物,含有稻谷中大部分的生理活性成分[1-3]。但目前我國對米糠的利用率只有20%左右,大部分用作動物飼料或者廢物丟棄,造成嚴(yán)重的資源浪費[4-5]。米糠本身化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定,碾米后米糠中的脂肪酶與油脂接觸,脂肪被水解生成游離脂肪酸,進(jìn)而在過氧化物酶、光、熱等因素的共同作用下發(fā)生脂肪氧化酸敗,使米糠酸敗變質(zhì)[6-9],難以長期貯存。

        目前國內(nèi)外穩(wěn)定米糠的方法有很多,但熱穩(wěn)定米糠會使部分米糠蛋白質(zhì)變性,抗氧化劑含量降低等問題[10-11]。 化學(xué)法穩(wěn)定米糠所需的化學(xué)試劑用量過多,不僅會造成米糠體系pH值過低,還可能存在化學(xué)殘留等問題[12-13]。酶法穩(wěn)定米糠是將蛋白酶與米糠和水混合,在一定溫度下維持一段時間以使脂肪酶失活的方法[14]。相比其他方法,酶法穩(wěn)定米糠不僅作用條件溫和,還能減少米糠成分變化和抗氧化劑化合物的損失。Laokuldilok等[15]選用 5 種蛋白酶對米糠進(jìn)行穩(wěn)定化處理,以處理前后米糠脂肪酶活力為指標(biāo),結(jié)果表明木瓜蛋白酶是穩(wěn)定米糠的最佳處理酶。

        木瓜蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解具有較好的催化活性[16-18], 但以游離酶的形式作用米糠,會存在易變性失活、反應(yīng)條件不易控制等缺點,而將其進(jìn)行固定化,不僅利于酶的分散和回收、增加循環(huán)使用次數(shù)還可提高穩(wěn)定性[19]。利用醋酸纖維素(cellolose acetate,CA)和聚四氟乙烯膜(polytetrafluoroethylene,PTFE)制成的CA-PTFE復(fù)合膜具有吸附性、化學(xué)穩(wěn)定性和機械性能優(yōu)異等特點[20-22],以此為載體固定化木瓜蛋白酶,不僅能使蛋白酶與底物快速分離,提高酶的重復(fù)利用率,降低生產(chǎn)成本,也實現(xiàn)了酶的催化功能和膜的分離、載體功能的有機結(jié)合。

        本實驗利用CA修飾PTFE制備了CA-PTFE復(fù)合膜,再以CA-PTFE復(fù)合膜為載體通過吸附交聯(lián)法固定化木瓜蛋白酶,以復(fù)合膜固定化酶對米糠進(jìn)行鈍化處理,探究酶膜鈍化米糠效果及工藝條件,考察酶膜的重復(fù)使用次數(shù)對酶活力的影響,研究鈍化后米糠的貯存穩(wěn)定性,為工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        新鮮米糠(水分13.6%) 湖北天星糧油股份有限公司;醋酸纖維素、木瓜蛋白酶(300 U/mg) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;聚四氟乙烯微孔膜(平均孔徑0.1 μm) 海寧市益博過濾器材廠;其他有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        DF-集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海耀特儀器設(shè)備有限公司;DK-2000-恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;LD4-2離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠; SM-03B型電子霧化加濕器 江蘇濕美電氣制造有限公司; S-3400N型高分辨場發(fā)射掃描電鏡 日本日立公司;UV9000紫外-可見分光光度計 上海元都有限公司;JY10002型號電子分析天平 上海精密儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 復(fù)合膜的制備

        將15.0 g醋酸纖維素60 ℃溶于85.0 g二甲基酰胺中得到鑄膜液。將PTFE膜先用0.1 mol/L的NaOH溶液和0.1 mol/L的HCl溶液清洗,再用去離子水清洗,真空干燥后平鋪在潔凈的玻璃板上??刂坪穸?,將醋酸纖維素鑄膜液用刮刀均勻涂在PTFE表面,在室溫下?lián)]發(fā)適當(dāng)?shù)臅r間完成干相轉(zhuǎn)換后,浸入去離子水完成濕相轉(zhuǎn)換。12 h后用去離子水清洗,自然干燥待用。

        1.3.2 木瓜蛋白酶的固定化

        采用吸附-交聯(lián)相結(jié)合的固定化方法,將7.5 g木瓜蛋白酶溶解于55 ℃、500 mL、pH 6的磷酸鹽緩沖溶液中配制成酶液,將CA-PTFE復(fù)合膜浸潤在酶液中,恒溫攪拌吸附4 h后,加入2.5 mL戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)3 h,反應(yīng)結(jié)束后用去離子水沖洗酶膜,放于干燥處待其風(fēng)干后測定酶活力。

        1.3.3 固定化酶膜載酶量的測定

        用單位面積的酶膜所固定的酶蛋白含量表示載酶量,采用Bradford[23]方法測定固定化前后的木瓜蛋白酶的酶液含量,同時測定清洗液中的酶蛋白含量,同一條件下平行重復(fù)實驗3 次,取平均值,實驗誤差在5%以下。根據(jù)式(1)計算載酶量:

        式中:C0為固定化前酶溶液蛋白質(zhì)量濃度/(mg/mL); C為固定化后溶液中蛋白質(zhì)量濃度/(mg/mL);Cw為清洗溶液蛋白質(zhì)量濃度/(mg/mL);V為固定化所用酶溶液體積/mL;Vw為清洗溶液體積/mL;W為浸入酶溶液中膜的面積/cm2。

        1.3.4 固定化酶膜酶活力的測定

        固定化酶活力用酶活力單位表示,測定固定化酶活力時,每次固定化酶膜兩份,其中一份做空白實驗,另一份加入樣品瓶中,參照游離酶活力測定[24]過程。將初始酶膜的酶活力記為100%,其余酶活力與其對比,即相對酶活力,如式(2):

        式中:A為初始固定化酶膜酶活力/(U/cm2);B為使用后固定化酶膜酶活力/(U/cm2)。

        1.3.5 米糠中脂肪酶活力測定

        參照Laokuldilok等[15]的對硝基苯酚月桂酸法并加以修改。溶液A:0.2 g PNPL溶解在30.0 mL異丙酮中;溶液B:6.0 g TritonX-100+3.0 g阿拉伯膠溶解在500 mL磷酸鹽緩沖液中。稱取0.5 g米糠分別加入0.2 mL溶液A和10 mL溶液B,振蕩混勻,35 ℃反應(yīng)30.0 min,沸水滅酶5.0 min后快速冷卻至室溫,混合液以4 000 r/min離心10 min,上清液即為米糠脂肪酶提取液。取上清液于410 nm波長處測定吸光度,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算對硝基苯酚濃度,根據(jù)取樣量計算脂肪酶活力,以相同條件下未經(jīng)酶解的米糠脂肪酶活力為基準(zhǔn)計算處理后米糠脂肪酶的相對活力。

        1.3.6 掃描電鏡

        將聚四氟乙烯膜、醋酸纖維素-聚四氟乙烯復(fù)合膜和醋酸纖維素-聚四氟乙烯復(fù)合膜固定的木瓜蛋白酶進(jìn)行電鏡掃描,觀察其形貌變化情況。

        1.3.7 復(fù)合膜固定化酶鈍化米糠中脂肪酶的方法

        在400 mm×400 mm×400 mm玻璃板制作的具有排風(fēng)的密封室內(nèi),支撐一塊300 mm×300 mm帶有溫控的電熱板,電熱板上放置一張不銹鋼網(wǎng)架,網(wǎng)架與電熱板溫度誤差為2 ℃,在網(wǎng)架上鋪一層酶膜,將厚度大約5 mm的米糠平鋪在酶膜上,米糠上再蓋一層酶膜。調(diào)節(jié)電熱板至一定溫度,為防止物料吸濕,使用電子霧化器調(diào)節(jié)密封室內(nèi)空氣的相對濕度,期間每隔10 min將米糠攪拌并翻置1 次,一定鈍化時間后,取樣于50 ℃真空干燥至含水量10.0%以下,測定米糠的脂肪酶活力并計算相對酶活力。

        1.3.8 單因素試驗設(shè)計

        研究在固定化酶鈍化米糠脂肪酶工藝參數(shù)的優(yōu)化,根據(jù)預(yù)實驗選擇空氣相對濕度、鈍化溫度和鈍化時間3 個因素對相對脂肪酶活力進(jìn)行單因素試驗。選擇優(yōu)化酶解鈍化工藝,單因素固定條件分別為空氣相對濕度80%、溫度70 ℃、時間100 min。研究空氣相對濕度分別為50%、60%、70%、80%、90%時對相對脂肪酶活力的影響;研究鈍化溫度分別為50、60、70、80、90 ℃時對相對脂肪酶活力的影響;研究鈍化時間分別為40、60、80、100、120 min對相對脂肪酶活力的影響。

        1.3.9 響應(yīng)面試驗設(shè)計

        綜合單因素試驗結(jié)果,采Box-Behnken模型,對空氣相對濕度(A)、鈍化溫度(B)、鈍化時間(C)這3 個因素進(jìn)行優(yōu)化,以相對脂肪酶活力(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析,使用Design-Expert 8.0.6設(shè)計響應(yīng)面試驗以優(yōu)化制油工藝參數(shù)。Box-Behnken設(shè)計試驗因素與水平見表1。

        表 1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used in Box-Behnken design

        1.3.10 固定化酶膜操作穩(wěn)定性分析

        在響應(yīng)面優(yōu)化的最佳條件下對米糠進(jìn)行鈍化處理,每次結(jié)束后,從酶膜上取約1 cm2的酶膜測定其酶活力,重復(fù)上述實驗過程,計算相對酶活力,考察重復(fù)使用次數(shù)對酶膜相對酶活力的影響。

        1.3.11 復(fù)合酶膜鈍化后米糠的貯存穩(wěn)定性

        對在最佳鈍化條件下處理后的米糠進(jìn)行貯存穩(wěn)定性研究,以未經(jīng)任何處理的新鮮米糠為對照(相對酶活力100%),將每個米糠樣品包裝在聚丙烯袋中并在一定環(huán)境溫度下貯存2 個月,在整個貯存期間測定米糠樣品相對脂肪酶活力。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

        所得數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實驗的平均值,數(shù)據(jù)采用Origin 9.0與Design Expert 8.0.6進(jìn)行分析和繪制。用SPSS 17.0進(jìn)行ANOVA單因素方差分析,并檢驗數(shù)據(jù)的差異顯著性,P<0.05,差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 酶膜載酶量及酶活力測定

        通過采用Bradford方法測定酶蛋白含量計算出單位面積酶膜的載酶量為0.75 mg/cm2,固定化酶膜的酶活力達(dá)到224.25 U/mg。雖然酶活力有所降低,但可增加重復(fù)利用次數(shù),避免了酶的大量流失。

        2.2 掃描電鏡分析

        圖 1 微孔膜及固定化酶膜的掃描電鏡圖Fig. 1 Scanning electron micrographs of microporous membrane and immobilized enzyme membrane

        從圖1a可知,空白PTFE微孔膜內(nèi)部呈纖維狀,錯亂交叉,排列不規(guī)則,開孔率比較高,其平均孔徑為0.1 μm,有較大的空間負(fù)載酶,但這種結(jié)構(gòu)表面平整光滑,不利于酶的固定化[25]。圖1b中CA-PTFE復(fù)合膜的表面平整、致密且均勻,這是由于經(jīng)醋酸纖維素修飾后,聚四氟乙烯膜內(nèi)部微孔被醋酸纖維素交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定性和生物兼容性得到提高,從而利于酶的固定[26]。圖1c中CA-PTFE復(fù)合膜表面大部被酶覆蓋,且在表面分布均勻,表明大部分的酶被固定在CA-PTFE的界面上,這種結(jié)構(gòu)較利于木瓜蛋白酶的固定化。

        2.3 單因素試驗結(jié)果分析

        2.3.1 鈍化時空氣相對濕度對相對脂肪酶活力的影響

        圖 2 空氣相對濕度對相對脂肪酶活力的影響Fig. 2 Effect of relative humidity of air on relative lipase activity

        由圖2可以看出,隨著操作室內(nèi)空氣相對濕度的增大,米糠相對脂肪酶活力呈先降低后平緩趨勢,在50%的空氣相對濕度下,脂肪酶相對酶活力最高為59.4%,當(dāng)空氣相對濕度大于80%時,相對酶活力的降低趨于平穩(wěn),這是因為體系濕度較大,利于酶膜對米糠的鈍化作用,但是由于酶的催化作用只與少部分與酶結(jié)合的“結(jié)合水”有關(guān),增大空氣相對濕度后,過高的水分含量會將酶和底物稀釋,從而降低酶促反應(yīng)速率[27],所以操作室內(nèi)的相對濕度要適當(dāng)。綜合考慮,空氣相對濕度在80%為宜。

        2.3.2 鈍化溫度對相對脂肪酶活力的影響

        圖 3 鈍化溫度對相對脂肪酶活力的影響Fig. 3 Effect of deactivation temperature on relative lipase activity

        由圖3可知,隨著溫度的升高,相對脂肪酶活力呈先降低后增加趨勢,當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時,相對酶活力達(dá)到最低。這是由于溫度升高后,木瓜蛋白酶的催化活性部位逐漸暴露,活性逐漸增強[28],與底物油脂競爭性的結(jié)合脂肪酶活性中心,從而阻礙脂肪酶與油脂結(jié)合,致使脂肪酶被鈍化,酶活力降低。而溫度繼續(xù)升高后,相對酶活力出現(xiàn)上升趨勢,這可能是因為較高溫度使酶膜上固定化酶部分失活所導(dǎo)致的,木瓜蛋白酶的有效作用溫度范圍是20~80 ℃,超過80 ℃時,木瓜蛋白酶活性會下降,溫度升高到90 ℃時木瓜蛋白酶會鈍化[29]。因此,固定化木瓜蛋白酶膜作用的最佳溫度在70 ℃左右。

        2.3.3 鈍化時間對相對脂肪酶活力的影響

        由圖4可以看出,隨著鈍化時間的延長,米糠的相對脂肪酶活力先急劇降低,在超過100 min后酶活力降低的速度減緩,在第120分鐘時達(dá)到最低,這是因為隨著時間的延長,酶膜的作用效果逐漸體現(xiàn)出來,雖然延長鈍化時間,有利于脂肪酶的鈍化效果,但時間過長會導(dǎo)致效率的下降,因此綜合考慮鈍化時間以100 min為宜。

        圖 4 鈍化時間對相對脂肪酶活力的影響Fig. 4 Effect of deactivation time on relative lipase activity

        2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化鈍化工藝

        2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

        綜合單因素試驗的結(jié)果,以空氣相對濕度(A)、鈍化溫度(B)、鈍化時間(C)3 個因素進(jìn)行優(yōu)化,以相對脂肪酶活力(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析,使用Design-Expert 8.0.6設(shè)計響應(yīng)面試驗以優(yōu)化參數(shù)。Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

        表 2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

        2.4.2 響應(yīng)面模型方程建立與顯著性分析

        利用Design-Expert軟件進(jìn)行擬合得到的空氣相對濕度(A)、鈍化溫度(B)和鈍化時間(C)與相對脂肪酶活力(Y)之間的二次多項回歸方程如下:

        利用Design Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行方差分析,響應(yīng)面二次模型的方差分析見表3。

        表 3 響應(yīng)面二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic model

        由表3可知,整體模型的F=174.65,P<0.000 1,模型極顯著,表明回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時,因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著,即這種實驗方法是可靠的。失擬項是用來表示模型與試驗擬合的程度,即二者差異的程度。表3中失擬項F值為1.09,P值為0.450 9,失擬項不顯著,表明該模型選擇正確,且模型中的調(diào)整系數(shù)R2Adj為98.99%,說明98.99%的響應(yīng)值變化可通過擬合模型進(jìn)行解釋,相關(guān)系數(shù)R2為99.56%,表明模型與實驗擬合良好,可以用此模型來分析和預(yù)測相對脂肪酶活力。從回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗可看出:一次項A和C對響應(yīng)值的影響極顯著,B對響應(yīng)值的影響不顯著。

        2.4.3 響應(yīng)面交互作用分析

        本研究考察空氣相對濕度、鈍化溫度和鈍化時間3 個因素對米糠的相對脂肪酶活力的影響,鈍化參數(shù)交互作用對相對脂肪酶活力的影響如圖5所示。

        圖 5 鈍化參數(shù)交互作用對相對脂肪酶活力的影響Fig. 5 Response surface plots showing the interactive effect of various factors on relative lipase activity

        從圖5可以看出,空氣相對濕度、鈍化時間、鈍化溫度3 個變量在兩兩交互時,保持其中1 個變量不變,隨著另外2 個變量的增加,相對脂肪酶活力呈現(xiàn)先降低的趨勢,當(dāng)達(dá)到一定值時又呈現(xiàn)出上升趨勢。3 個因素中AC和BC交互作用為極顯著,AB是不顯著,即空氣相對濕度和鈍化時間之間以及鈍化溫度和鈍化時間之間有極顯著交互作用,空氣相對濕度和鈍化溫度之間的交互作用不顯著。通過試驗設(shè)計優(yōu)化得到酶膜穩(wěn)定米糠的最佳工藝參數(shù)為空氣相對濕度72.2%、鈍化溫度70.5 ℃、鈍化時間113.4 min,該條件下米糠的相對脂肪酶活力預(yù)測值為34.8%。根據(jù)實際情況將工藝參數(shù)進(jìn)行整理,得出整理值為空氣相對濕度72%、鈍化溫度71 ℃、鈍化時間113 min。在此條件下進(jìn)行3 次平行實驗,該條件下相對脂肪酶活力平均值為35.2%。實測值與預(yù)測值之間具有良好的擬合性,從而證實了模型的有效性。同時,測定了在此最佳工藝參數(shù)下固定化酶膜鈍化后米糠的過氧化物酶活力[30],以新鮮米糠的過氧化物酶活力記為100%,測定結(jié)果為過氧化物酶的相對酶活力降到了23.3%,結(jié)果表明此方法可以有效鈍化米糠中的關(guān)鍵酶,從而提高米糠的貯存穩(wěn)定性。

        2.5 固定化酶膜的操作穩(wěn)定性

        圖 6 重復(fù)使用次數(shù)對固定化酶膜相對酶活力的影響Fig. 6 Effect of number of repeated use on relative activity of immobilized enzyme membrane

        在響應(yīng)面優(yōu)化的最佳條件下(空氣相對濕度72%、鈍化溫度71 ℃、鈍化時間113 min)處理米糠后,重復(fù)使用次數(shù)對固定化酶膜相對酶活力的影響如圖6所示。由圖6可看出,酶膜的相對酶活力隨重復(fù)使用次數(shù)的增加而降低,經(jīng)10 次使用后,相對酶活力為54.2%。這可能是由于隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加,酶膜受到的機械損傷增加,出現(xiàn)部分破損、部分固定化酶脫落的現(xiàn)象,均會導(dǎo)致固定化酶活性的降低。同時由于酶本身的失活也會直接導(dǎo)致固定化酶相對酶活力的降低。但酶膜在重復(fù)使用6 次后,相對酶活力仍可保持在73.0%以上,這一結(jié)果與梁單瓊等[21]研究固定化脂肪酶膜的結(jié)果一致,說明此酶膜具有良好的操作穩(wěn)定性。

        2.6 復(fù)合酶膜鈍化后米糠的貯存穩(wěn)定性

        圖 7 貯存期間固定化酶膜鈍化后米糠中相對脂肪酶活力的變化Fig. 7 Changes in relative lipase activity of rice bran treated with the immobilized enzyme membrane during storage

        由圖7可以看出,在2 個月的貯存期間里,經(jīng)固定化木瓜蛋白酶膜鈍化后的米糠,其相對脂肪酶活力仍低于36.0%,幾乎無明顯變化。這與Laokuldilok等[15]研究用木瓜蛋白酶處理的米糠,在2 個月貯存期間里脂肪酶活力變化基本一致,結(jié)果證實,應(yīng)用固定化木瓜蛋白酶膜穩(wěn)定米糠是一種能有效提高米糠貯存穩(wěn)定性的方法。

        3 結(jié) 論

        本實驗針對米糠的不穩(wěn)定性質(zhì)導(dǎo)致其利用率低的缺點,應(yīng)用CA-PTFE復(fù)合膜固定化木瓜蛋白酶對米糠進(jìn)行鈍化處理,降低了米糠中脂肪酶的活力并以此為指標(biāo),通過響應(yīng)面法優(yōu)化了空氣相對濕度、鈍化溫度和鈍化時間對鈍化效果的影響,確定了固定化酶膜鈍化米糠脂肪酶的最佳鈍化條件,在最佳條件下處理后的米糠相對脂肪酶活力為35.2%,表明米糠中的脂肪酶得到有效鈍化。且穩(wěn)定后的米糠貯存2 個月后,其相對脂肪酶活力仍低于36.0%,同時固定化木瓜蛋白酶酶膜重復(fù)使用6 次后的相對酶活力仍保持在73.0%以上。本實驗在提高米糠穩(wěn)定性同時,解決了傳統(tǒng)游離蛋白酶鈍化米糠不可重復(fù)利用的問題,降低了生產(chǎn)成本,為酶法穩(wěn)定米糠提供了新工藝與理論依據(jù)。

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