林曉彤，潘 力,2，羅時(shí)渝，王 斌,2,

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

黑曲霉（Aspergillus niger）屬于絲狀真菌的一種，具有旺盛的蛋白表達(dá)分泌能力以及強(qiáng)大的繁殖能力，普遍應(yīng)用于工業(yè)重組蛋白、檸檬酸等的生產(chǎn)[1-2]，被廣泛用于重組蛋白的表達(dá)[3-5]。黑曲霉被美國美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證為GRAS（Generally Regarded as Safe）范圍的安全菌種[6]。

葡萄糖氧化酶（EC 1.1.3.4）是一種氧化還原酶，廣泛分布在自然界的微生物、植物和動物體內(nèi)。當(dāng)有氧氣存在時(shí)，葡萄糖氧化酶可專一性地催化β-D-葡萄糖，將其分解成葡萄糖酸內(nèi)酯和過氧化氫[7]。作為一種新型的綠色天然酶制劑，在食品業(yè)、醫(yī)療醫(yī)藥業(yè)、釀酒業(yè)、畜牧業(yè)以及紡織業(yè)等領(lǐng)域中應(yīng)用十分廣泛[8-10]。葡萄糖氧化酶最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)初，之后Muller[11]在黑曲霉的無細(xì)胞提取液中首次發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶，并對其催化機(jī)理進(jìn)行較為深入的研究；Keilin等[12]首次于灰綠青霉（Penicilliumglaucum）中發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶。顧磊[13]使用畢赤酵母異源表達(dá)黑曲霉來源葡萄糖氧化酶，胞外酶活力達(dá)到 52 U/mL，同時(shí)通過對 HAC1、CNE1、SEC53等轉(zhuǎn)錄因子的改造，使酶活力達(dá)到1 972.9 U/mL，為近年來最高。

隨著對葡萄糖氧化酶工業(yè)生產(chǎn)的研究的不斷深入，其產(chǎn)量也不斷提高，周亞鳳等[14]將黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母Pichia pastoris GS115，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵3～4 d后酶活力可達(dá)30～40 U/mL；母敬郁等[15]用黑曲霉來源葡萄糖氧化酶基因轉(zhuǎn)化瑞氏木霉，其酶活力達(dá)到25 U/mL；Kapat等[16]用重組的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae表達(dá)葡萄糖氧化酶，酶活力達(dá)到3.17 U/mg。Gao Zhaowei等[17]采用點(diǎn)青霉F4的葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母GS115中異源表達(dá)，發(fā)酵葡萄糖氧化酶活力達(dá)到615 U/mL；陳楠等[18]在畢赤酵母SMD1168中異源表達(dá)黑曲霉PCTC的葡萄糖氧化酶基因，經(jīng)篩選、產(chǎn)酶條件優(yōu)化，最高酶活力達(dá)到32 U/mL。目前常用的高效表達(dá)菌株主要是畢赤酵母的重組改造菌[19]，其通過異源表達(dá)黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶基因達(dá)到很高的酶活力，美國Sigma公司生產(chǎn)的商品葡萄糖氧化酶比活力為266.82 U/mg[20]。但食品級安全的葡萄糖氧化酶工業(yè)產(chǎn)能仍比較低，幾種食品級安全菌種都有或多或少的缺點(diǎn)，如黑曲霉宿主同源表達(dá)產(chǎn)量普遍較低且雜蛋白過多、釀酒酵母產(chǎn)酶糖基化修飾過多等。

針對黑曲霉本身產(chǎn)量低、雜蛋白多等問題，本課題利用低蛋白背景的無孢黑曲霉SH2及HL1作為宿主，以密碼子優(yōu)化后的黑曲霉CBS513.88來源goxC基因?yàn)榛A(chǔ)，構(gòu)建2 種啟動子不同的葡萄糖氧化酶表達(dá)框，表達(dá)黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶。通過表型板篩選、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）鑒定和搖瓶發(fā)酵確定葡萄糖氧化酶活力最高的轉(zhuǎn)化子，以期在提高葡萄糖氧化酶產(chǎn)量的同時(shí)，為提高食品級安全的葡萄糖氧化酶工業(yè)產(chǎn)量提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）Match 1T1感受態(tài)購自美國Invitrogen公司；黑曲霉菌株SH-2和HL1由本實(shí)驗(yàn)室改造并保存；PUC57-goxC-opt載體（含密碼子偏好性優(yōu)化的PCV2-cap基因）由本南京金斯瑞公司合成，表達(dá)載體pMD18-TP均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 試劑

所有限制性內(nèi)切酶（如ApaI）、DNA聚合酶 美國TaKaRa公司；NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit 美國NEB公司；鄰聯(lián)茴香胺、辣根過氧化物酶 北京普博欣公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，1% NaCl，0.5%酵母提取液；CD培養(yǎng)基：2%葡萄糖，0.3% NaNO3，0.2 % KCl，0.05% MgSO4·7H2O，0.1% KH2PO4，0.001% FeSO4·7H2O，2%瓊脂粉，pH 5.5；發(fā)酵培養(yǎng)基：5%玉米淀粉，3%玉米漿，2%豆粕粉。

1.2 儀器與設(shè)備

微量移液器、高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf 公司；酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR儀 美國Applied Biosystems公司；AKATA層析儀 美國通用電氣公司；浸入式水平電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)PUC57-goxC-opt載體中優(yōu)化后的葡萄糖氧化酶基因序列設(shè)計(jì)引物（表1）。引物對goxC1770-F/g o x C 1 8 1 8-R 用于擴(kuò)增去除信號肽的g o x C 基因（GenBank：XM_001389825.2），引物對PglaA1296-F/Pgla1296-R和Pna2/tpi-F/Pna2/tpisig-R分別擴(kuò)增糖化酶啟動子和雜合啟動子Pna2/tpi（由淀粉酶amyB基因的啟動子和tpi基因的5’UTR組成），啟動子3’連有糖化酶信號肽，5’具有ApaI酶切位點(diǎn)。

表 1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Sequences of PCR primers used in this study

1.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以PUC57-goxC-opt載體為模板，使用特異性引物goxC1770-F和goxC1818-R擴(kuò)增得到goxC基因，將目的基因goxC、啟動子和改造后的pMD18線性化載體（含有篩選標(biāo)記pyrG及TglaA）通過同源片段在NEB HiFi連接酶的作用下連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Amp抗性篩選，通過菌液電泳驗(yàn)證質(zhì)粒大小是否正確，分別得到糖化酶啟動子和雜合啟動子的重組表達(dá)載體。經(jīng)測序驗(yàn)證后，將構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體命名為pMD18-PglaAgoxC和pMD18-Pna2/tpi-goxC，如圖1所示，使用ApaI單酶切線性化。

圖 1 重組表達(dá)質(zhì)粒pMD18-PglaA-goxC和 pMD18-Pna2/tpi-goxC的 構(gòu)建圖譜Fig. 1 Construction maps of pMD18-PglaA-goxC and pMD18-Pna2/tpi-goxC

1.3.3 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

通過酶解法制備黑曲霉宿主SH2[21]和HL1的原生質(zhì)體[22]，將線性化的表達(dá)載體pMD18-PglaA-goxC與SH2原生質(zhì)體，pMD18-Pna2/tpi-goxC與HL1原生質(zhì)體相混合，利用CaCl2-聚乙二醇法誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化[23]，涂布于高滲CD平板上30 ℃恒溫培養(yǎng)。通過鄰聯(lián)茴香胺-過氧化物酶法顯色和PCR定位鑒定轉(zhuǎn)化子，檢測goxC基因是否整合入黑曲霉宿主基因組中，得到重組菌株SH2-goxC和HL1-goxC的陽性轉(zhuǎn)化子。

1.3.4 重組表達(dá)菌株的搖瓶發(fā)酵及酶活力檢測

將重組菌株SH2-goxC和HL1-goxC的陽性轉(zhuǎn)化子接種于液體淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)，按24 h間隔分別取樣，8 000×g離心5 min，收集上清液。發(fā)酵液稀釋至合適的倍數(shù)，用鄰聯(lián)茴香胺-過氧化物 酶法[24-26]檢測其在540 nm波長處的吸光度，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活力單位定義為：在45 ℃和pH 5.5條件下，每分鐘將1 μmol葡萄糖分解為葡萄糖酸內(nèi)酯和過氧化氫所需 的酶量[27]。

1.3.5 重組表達(dá)菌株的50 L發(fā)酵罐發(fā)酵

將構(gòu)建的重組菌株SH2-goxC進(jìn)行50 L發(fā)酵罐發(fā)酵。玉米淀粉8%，黃豆餅粉2%，玉米漿2%，消泡劑（聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚）0.08%，高溫淀粉酶（40 000 U/g）30 U/g。參數(shù)控制為：罐壓0.05～0.06 MPa，初始罐溫34 ℃，初始通風(fēng)量1～6 m3/h （根據(jù)溶氧量調(diào)），轉(zhuǎn)速200～800 r/min（根據(jù)溶氧量調(diào)），溶氧量前期控制在50%以上，中后期按最大通風(fēng)量和轉(zhuǎn)速運(yùn)轉(zhuǎn)，降低時(shí)補(bǔ)氨維持在pH 4.5。淀粉水解度降至10左右開始補(bǔ)料，之后控制水解度在5～10之間。

1.3.6 重組葡萄糖氧化酶的純化和去糖基化

由于重組葡萄糖氧化酶帶有6×His標(biāo)簽，故采用鎳柱親和層析純化重組蛋白，重組菌株SH2-goxC經(jīng)搖瓶培養(yǎng)7 d后，收集上清液用于純化。使用的層析柱為HisTrapTMHP，上樣量為30 mL，采用梯度洗脫法（咪唑濃度0～0.5 mol/L），流速為2.0 mL/min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測純化效果。同時(shí)用肽N-糖苷酶F去糖基化，再用SDS-PAGE檢測。

1.3.7 重組葡萄糖氧化酶酶學(xué)特性分析

最適溫度和pH值測定：在pH 5.5條件下，設(shè)置不同溫度梯度25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃測定酶活力隨溫度的變化；在測得的最適反應(yīng)溫度條件下，測定不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）條件下的酶活力，以最適pH值條件下所得的酶活為100%。

在最適溫度或pH值下酶活力隨保溫時(shí)間變化的關(guān)系：pH 5.5條件下，測在最適溫度條件下保溫0、1、2、3、4、5、6、7、8 h后酶液的酶活力，以保溫時(shí)間0 h的酶活力為100%；最適溫度條件下，將葡萄糖氧化酶置于最適pH值緩沖溶液中，測定最適溫度下保存0、1、2、3、4、5、6、7、8 h后的酶活力，以保溫時(shí)間0 h的酶活力為100%。

金屬離子及表面活性劑對葡萄糖氧化酶活性的影響：在標(biāo)準(zhǔn)測定體系中分別加入不同金屬離子及表面活性劑SDS、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）使其終濃度為10、100 mmol/L，測定酶活力，以未經(jīng)處理組的酶活力為100%。

2 結(jié)果與分析

圖 2 pMD18-PglaA-goxC和 pMD18-Pna2/tpi-goxC重組 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證 Fig. 2 Identification of pMD18-PglaA-goxC and pMD18-Pna2/tpi-goxC vector transformants

2.1 重組表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證

pMD18-PglaA-goxC和pMD18-Pna2/tpi-goxC表達(dá)載體質(zhì)粒全長分別為10 112 bp和9 623 bp，隨機(jī)挑取陽性大腸桿菌轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，并用ApaI酶切，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示，表明挑取的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒大小正確（圖2a、c）。選取酶切驗(yàn)證正確（圖2b、d）的菌株送樣至Invitrogen公司測序，確定得到含有正確表達(dá)載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。

2.2 重組表達(dá)菌株的篩選

圖 3 SH2-goxC和HL1-goxC轉(zhuǎn)化子鑒定Fig. 3 Identification of SH2-goxC and HL1-goxC transformants

先通過鄰聯(lián)茴香胺-過氧化物酶法顯色篩選[28-29]，SH2-goxC顯色轉(zhuǎn)化子有16 株，HL1-goxC顯色轉(zhuǎn)化子有5 株，使用篩選標(biāo)記pyrG（1 398 bp）的擴(kuò)增引物直接PCR驗(yàn)證重組子，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR的結(jié)果和顯色篩選板如圖3所示，兩種轉(zhuǎn)化子PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陽性，表明goxC基因成功非同源整合到宿主的基因組上。

2.3 重組表達(dá)菌株的酶活力檢測結(jié)果

挑選重組菌株SH2-goxC中的4 株5、23、26、39號，以及HL1-goxC中的4 株1、4、9、10號搖瓶發(fā)酵，每24 h取發(fā)酵液上清液測葡萄糖氧化酶活力。重組菌株SH2-goxC在第7天達(dá)到最大值，如圖4所示，5號表達(dá)株的葡萄糖氧化酶活力最高，可達(dá)563.8 U/mL，對照組（即宿主）無酶活力。重組菌株HL1-goxC在第3天達(dá)到最大值，如圖4所示，9號表達(dá)株的葡萄糖氧化酶活力最高，可達(dá) 635.1 U/mL，對照組（即宿主）無酶活力。

圖 4 SH2-goxC和HL1-goxC轉(zhuǎn)化子酶活力測定Fig. 4 GOD activities of SH2-goxC and HL1-goxC transformants

2.4 重組表達(dá)菌株的50 L發(fā)酵罐發(fā)酵

選取SH2-goxC 5號轉(zhuǎn)化子進(jìn)行50 L發(fā)酵罐發(fā)酵。在搖瓶培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的供氧不斷減少，并且營養(yǎng)條件也不能保證菌體迅速生長。而發(fā)酵罐的連續(xù)補(bǔ)料、調(diào)節(jié)pH值等方式，使菌體可以快速生長。如圖5所示，在179 h時(shí)，發(fā)酵酶活力達(dá)到最大，為1 128 U/mL。

圖 5 SH2-goxC轉(zhuǎn)化子50 L發(fā)酵罐發(fā)酵酶活力Fig. 5 GOD activity of SH2-goxC transformant in 50-L fermentor

2.5 重組葡萄糖氧化酶的純化及去糖基化

將發(fā)酵液上清液經(jīng)過親和層析，蛋白純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，如圖6a所示。再將純化后的葡萄糖氧化酶樣品做去糖基化，如圖6b所示，去糖基化后的酶樣品與條帶2未做去糖基化處理的酶樣品相比大小降了20 kDa左右，由此可見重組葡萄糖氧化酶是糖蛋白。

圖 6 葡萄糖氧化酶表達(dá)的SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig. 6 SDS-PAGE analysis of the expression of GOD

2.6 葡萄糖氧化酶酶學(xué)性質(zhì)

2.6.1 溫度對純化后重組葡萄糖氧化酶活力的影響

葡萄糖氧化酶在4 5 ℃時(shí)酶活力最高，而且在35～50 ℃時(shí)酶活力較穩(wěn)定（圖7a）；將酶液置于最適溫度下測定葡萄糖氧化酶活力，隨著保溫時(shí)間的延長，酶活力在0～2 h略微穩(wěn)定，2 h之后酶活力略微下降，到了3 ～4 h 時(shí)趨于穩(wěn)定，4 h 后急劇下 降（圖7b）。

圖 7 溫度對純化后重組葡萄糖氧化酶活力的影響Fig. 7 Effects of temperature on the activity of purified recombinant GOD

2.6.2 pH值對純化后重組葡萄糖氧化酶活力的影響

葡萄糖氧化酶在pH 5.5時(shí)酶活力最高，而且在pH 4.5～5.5時(shí)酶活力較穩(wěn)定（圖8a）；將酶液置于最適pH值下測定葡萄糖氧化酶的酶活力，隨著保溫時(shí)間的延長，酶活力在0～2 h略微下降，2 h之后酶活力急劇下降，到了3 h后穩(wěn)定下降（圖8b）。

圖 8 pH值對純化后重組葡萄糖氧化酶活力的影響Fig. 8 Effects of pH on the activity of purified recombinant GOD

2.6.3 金屬離子及化學(xué)試劑對重組酶的影響

圖 9 金屬離子及表面活性劑對葡萄糖氧化酶活力的影響Fig. 9 Effects of metal ions and surfactants on the activity of GOD

圖9表明，在10 mmol/L濃度下，Ni2+、Ca2+、K+、 Zn2+、Mg2+增加葡萄糖氧化酶的活性，其中Ca2+、Zn2+大約能提高葡萄糖氧化酶活力20%，Mg2+大約能提高葡萄糖氧化酶活力25%，Ni2+、K+大約能提高葡萄糖氧化酶活力30%；EDTA、Fe3+對葡萄糖氧化酶活力影響很?。籗DS或Na+明顯降低葡萄糖氧化酶活力。在100 mmol/L濃度下，SDS、Ni2+、K+增加葡萄糖氧化酶活力，提高葡萄糖氧化酶活力30%～50%；EDTA、Na+明顯降低葡萄糖氧化酶活力；Ca2+、Zn2+、Fe3+、Mg2+對葡萄糖氧化酶活力影響很小。Mn2+在10 mmol/L及100 mmol/L濃度下，均對葡萄糖氧化酶活力有較大提升，在10 mmol/L濃度下提高葡萄糖氧化酶活力80%，在100 mmol/L濃度下酶活力達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)酶活力的270%。

3 討 論

黑曲霉作為重組蛋白表達(dá)的重要宿主，具有蛋白分泌量大、可進(jìn)行蛋白翻譯后修飾及高生物安全性等 優(yōu)點(diǎn)[30]。本研究通過密碼子優(yōu)化、信號肽替換，優(yōu)化黑曲霉CBS513.88來源goxC基因，并分別以糖化酶啟動子和雜合啟動子，glaA糖化酶終止子作為表達(dá)載體元件，pyrG為雙向篩選標(biāo)記，構(gòu)建葡萄糖氧化酶重組表達(dá)載體，經(jīng)過非同源重組分別轉(zhuǎn)化黑曲霉SH2和HL1，使葡萄糖氧化酶基因得以高效表達(dá)。通過表型板篩選、PCR鑒定選出成功轉(zhuǎn)化的重組葡萄糖氧化酶菌株，測定發(fā)酵上清液的酶活力，選出重組表達(dá)酶活力最高的轉(zhuǎn)化子菌株SH2-goxC 5號和HL1-goxC 9號，分別達(dá)到563.8 U/mL和658.3 U/mL，并將SH2-goxC 5號上罐發(fā)酵，酶活力最高達(dá)到1 128 U/mL，提高了1 倍以上。對重組葡萄糖氧化酶進(jìn)行親和層析純化，SDS-PAGE鑒定顯示蛋白分子質(zhì)量大小在80 kDa左右，經(jīng)過去糖基化驗(yàn)證得到蛋白分子質(zhì)量大小為65 kDa左右，表明重組葡萄糖氧化酶具有糖基化位點(diǎn)。同時(shí)驗(yàn)證了溫度、pH值對葡萄糖氧化酶活力的影響，葡萄糖氧化酶在pH 5.5時(shí)酶活力最高，而且在pH 4.5～5.5時(shí)酶活較穩(wěn)定；葡萄糖氧化酶在溫度45 ℃時(shí)酶活力最高，30～50 ℃時(shí)酶活力較穩(wěn)定。

本研究結(jié)果為食品級安全葡萄糖氧化酶的工業(yè)發(fā)酵表達(dá)量的提高提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。后續(xù)可以進(jìn)一步研究黑曲霉宿主的改造以及葡萄糖氧化酶的定點(diǎn)突變研究，以得到酶活力更高的黑曲霉菌株。