(湖北安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003)

腌制是傳統(tǒng)的食品加工保鮮工藝,腌制肉制品是現(xiàn)代肉品加工中的重要環(huán)節(jié)[1]。它能夠使肉品呈現(xiàn)特有色澤,產(chǎn)生特有風(fēng)味,改善肉的品質(zhì),延長(zhǎng)貨架期[2]。肉制品的色澤是影響消費(fèi)者購(gòu)買的決定性因素,褪色容易給人一種腐敗的錯(cuò)覺(jué),褪色嚴(yán)重影響產(chǎn)品的外觀品質(zhì)[3],降低產(chǎn)品的商品價(jià)值,甚至無(wú)法銷售,但由于生產(chǎn)工藝和貯藏條件等因素,蒸煮腌肉制品在冷藏期間褪色現(xiàn)象普遍存在,褪色是限制蒸煮肉制品發(fā)展的主要原因[4-5]。

有關(guān)腌制肉制品品質(zhì)因素和貨架期的關(guān)系的研究較多,大多集中在微生物因素、貯藏溫度、貯藏時(shí)間、肉制品的質(zhì)構(gòu)特征和其他因素(包裝方式、pH、水分活度)等方面[6]。段紅敏[7]研究了包裝材料對(duì)醬鹵類低溫肉制品品質(zhì)影響;王新惠等[8]研究了儲(chǔ)藏溫度對(duì)臘肉品質(zhì)的影響;王梓昂[9]報(bào)道了基于預(yù)測(cè)微生物學(xué)理論對(duì)真空包裝醬牛肉進(jìn)行貨架期預(yù)測(cè);茍惠天等[10]報(bào)道了細(xì)胞凋亡酶在肉品成熟過(guò)程中對(duì)其嫩度影響;Mancini等[11]報(bào)道表明高pH可以維持蒸煮豬肉產(chǎn)品的粉紅色,而且可以延長(zhǎng)冷藏期間產(chǎn)品紅色的保持時(shí)間。目前對(duì)影響腌制品肉品質(zhì)的多因素的綜合研究還比較少。

本文通過(guò)主成分分析(PCA)法研究了豬肉切片的色澤、理化指標(biāo)、游離氨基酸、生物胺和一些氧化指標(biāo),系統(tǒng)的了解了蒸煮腌制肉制品在冷藏期間的色澤變化同氮的存在形式及氧化狀態(tài)的關(guān)系,對(duì)有效改善蒸煮腌制肉制品褪色等方面提供了理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的豬肉 購(gòu)于荊州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),在實(shí)驗(yàn)室按照食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)自制成西式蒸煮火腿切片;色胺(TRY)、腐胺(TUT)、尸胺(CAD)、酪胺(TYR)、苯乙胺(PHE)、亞精胺(SPD)、精胺(SPM)、游離氨基酸(FAA)、衍生丹黃酰氯(dansyl chloride) 標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)Sigma公司;乙腈、正己烷 色譜純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;丙酮、石油醚(沸程為30～60 ℃)、乙酸乙酯、NaNO2分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;抗壞血酸鈉、磷酸鹽 食品純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

18W/830熒光燈管 飛利浦照明股份有限公司;FSH-II型高速電動(dòng)勻漿器 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠;Allegra X-30R多功能臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司;日立全自動(dòng)氨基酸分析儀L-890 日本日立公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1200B 日本EYELA東京理化;TU-1900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;PURELAB classic系列純水機(jī) 英國(guó)ELGA;CENTER?337照度計(jì) 臺(tái)灣NORTHERN BANKER ART有限公司;TM-902C中心溫度計(jì) 南京萬(wàn)達(dá)有限公司;CR 400便攜式色差儀(D65光源) 日本Minolta公司;Waters Alliance 2695高效液相色譜儀(UV檢測(cè)器:Waters 2487AgilentZORBAXXDB-C18柱,4.6 mm×250 mm,5 μm) 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理 根據(jù)Dineen等[12]、孫衛(wèi)青等[13]的方法加以改善制備蒸煮腌制豬肉切片,將從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買的新鮮的原料豬肉剔除脂肪、筋膜和表面血污,用消毒后的菜刀將粗處理后的原料肉分割成1 cm×1 cm×5 cm左右的肉塊。按照每1 kg的肉加入NaNO2150 mg,抗壞血酸鈉400 mg和食鹽20 g的量配制腌制液,在用篩板孔徑10 nm的絞肉機(jī)絞碎的肉塊中加入10%腌制液,然后一起放入斬拌機(jī)中做成肉糜,用鋁箔袋真空包裝(1 kg/袋),放在(4±1) ℃下發(fā)色48 h后裝入容量為1.25 kg的火腿模具,(80±1) ℃水浴加熱50 min,中心溫度達(dá)到了72 ℃左右,然后將模板取出放置在(4±1) ℃下冷卻4 h。將火腿脫模切片后按照每袋25 g的量真空包裝。模擬超市西式蒸煮火腿切片冷藏櫥窗儲(chǔ)存環(huán)境,將樣品單層平鋪在控溫冰箱的隔板上,上面45 cm處固定2支熒光燈管,環(huán)境溫度為(8±1) ℃,在1000 lx光照強(qiáng)度下。取樣速凍在-80 ℃的冰箱直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,同時(shí)在1、7、14、21、28和35 d的時(shí)候測(cè)定樣品表觀色澤和色素含量,所有的指標(biāo)都重復(fù)測(cè)3次。

1.2.2 色澤參數(shù)的測(cè)定

1.2.2.1 色澤的測(cè)定 豬肉切片表觀色澤使用CR 400色差儀測(cè)定,先用標(biāo)準(zhǔn)板校對(duì)色差儀,用L*、a*、b*系統(tǒng)測(cè)定樣品色澤參數(shù)。

Hue=tan-1(b*/a*)

式(1)

C=(a*2+b*2)1/2

式(2)

1.2.2.2 水分、pH、鹽分及亞硝酸鹽含量的測(cè)定 水分的測(cè)定參照GB/T 5009.3-2010方法[14];pH的測(cè)定參照GB/T 9695.5-2008方法[15];鹽分的測(cè)定參照GB/T 12457-2008方法[16];亞硝酸鹽的測(cè)定參照GB/T 5009.33-2010方法[17]。

1.2.2.3 亞硝基血色原(NH)的測(cè)定 參照Hornsey[18]的方法并改善。在微弱紅光的暗室中,準(zhǔn)確稱取碎肉樣品10 g,加入丙酮水溶液(40∶2.7,V/V)42.7 mL,在氮吹條件下攪拌均勻,密封后放在黑暗中靜置10 min,然后離心(3000 r/min,5 min,4 ℃),過(guò)濾后在540 nm處比色,亞硝基血紅素在540 nm吸光度乘以因子290為肉中亞硝基血紅素濃度。

NH(mg/kg)=A540×290

1.2.3 生物胺及游離氨基酸含量的測(cè)定

1.2.3.1 生物胺的測(cè)定 按照孫衛(wèi)青[19]的方法測(cè)定,HPLC設(shè)備和液相條件:Waters Alliance 2695 Separationgs Module高效液相色譜系統(tǒng),紫外檢測(cè)器:Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector;XDB-C18柱。柱溫為30 ℃;流速1.0 mL/min;注射體積為20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為254.8 nm;流動(dòng)相為水和乙腈。

1.2.3.2 游離氨基酸的測(cè)定 按照孫衛(wèi)青[5]的方法,將處理好的樣品用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè),除羥脯氨酸在440 nm處檢測(cè)外,其他的氨基酸都在570 nm處檢測(cè)。

1.2.4 蛋白質(zhì)和脂肪氧化相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.2.4.1 蛋白質(zhì)(Pr)和非蛋白氮(NPN)含量的測(cè)定 按照孫衛(wèi)青[19]的方法處理后,用自動(dòng)凱式定氮儀測(cè)定。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)羰基衍生物(CARB)的測(cè)定 參考Agnès等[20]、Mercier等[21]的方法做適當(dāng)修改。量取500 mL肌原纖維蛋白溶液(9 mg/mL)在7 mL離心管中,離心(4 ℃,2000×g,10 min)取沉淀物,其中一份加入2 mL HCl,另一份加入2 mL 0.2%(w/v)的DNPH,在室溫避光靜置1 h,在此期間每隔10 min振蕩一次,然后加入2 mL 10%沉淀羥基化蛋白反應(yīng)物(TCA),離心(4 ℃,2000×g,10 min)取沉淀物,用2 mL乙醇和乙酸乙酯(1∶1,V/V)混合液洗沉淀,然后離心(4 ℃,2000×g,10 min)取沉淀,重復(fù)3次。加入2 mL 6 mol/L鹽酸胍(20 mmol/L PBS,pH6.5),溶解沉淀,水浴(37 ℃,15 min),離心后取上清液,用鹽酸胍溶液調(diào)零,HCl處理組(未加DNPH)為空白對(duì)照,在370 nm測(cè)定吸光值,結(jié)果以每毫克蛋白中羰基含量表示。

表1 豬肉切片冷藏期間色澤參數(shù)及其他品質(zhì)指標(biāo)的變化Table 1 Changes of color parameters and other quality indicators of pork slices during cold storage

蛋白羰基含量(nmol/mg prot)=(A×L/22000×L×C)×D

式(3)

式中:A為吸光值;C為蛋白質(zhì)濃度,mg/L;L為光程,1 cm;D為稀釋倍數(shù);22000為蛋白質(zhì)吸收系數(shù),L/(mol·cm)。

1.2.4.3 游離巰基(SH)的測(cè)定 參考Agnès 等[20]的方法。準(zhǔn)確稱取碎肉樣品10 g,加入含8 mol/L尿素的100 nmol/L PBS(pH為8)20 mL,冰浴勻漿4×10 s,靜置30 min,然后離心(10000×g,10 min,4 ℃)取上清液,加入1 mL蛋白質(zhì)溶液到10 μL的10 mmol/L DTNP(2,2′-二硫代雙吡啶(2,2′-dithiobis)),在室溫下反應(yīng)1 h后在386 nm處測(cè)其吸光度,空白樣用不含DTNP的同樣濃度的蛋白質(zhì),減去稀釋的DTNP的吸光度。

式(4)

式中:C為蛋白質(zhì)濃度,mg/L;A為處吸光值;D為稀釋倍數(shù);ε為摩爾消光系數(shù),13600 L(mol·cm);L為光程,1 cm。

1.2.4.4 脂肪氧化形成的羰基值(FCARB)和雙烯值(DV)的測(cè)定 脂質(zhì)的提取參考Folch等[22]的方法。取樣品8 g剪碎,然后加入甲烷-甲醇混合物(2∶1,V/V)溶液,在冰浴的條件下勻漿(4000 r/min,60 s),靜置后過(guò)濾,按照1∶0.22加入NaCl(0.73%)和CaCl2(0.04%)混合溶液(W/V),離心(3000 r/min,5 min,4 ℃),除去上層及膜狀雜質(zhì)后將下層液體放入燒瓶中,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上抽真空(40 r/min),同時(shí)45 ℃水浴,得到純品油脂。用環(huán)己烷溶解得到的油脂,稀釋到200 μg/mL,并在215、232、275 nm處測(cè)定其吸光度。環(huán)己烷作為空白對(duì)照組。

式(5)

式(6)

1.2.4.5 抑制羥自由基能力(IC·OH)的測(cè)定 采用IC·OH試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差;利用SPSS 19.0軟件對(duì)樣品西式蒸煮火腿切片測(cè)得的理化指標(biāo),生物胺指標(biāo)和游離氨基酸指標(biāo)進(jìn)行主成分分析(PCA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 豬肉切片冷藏期間色澤參數(shù)變化

從表1可知,豬肉切片在冷藏期間在第1～7 d除了Hue外,其他品質(zhì)指標(biāo)均發(fā)生顯著性變化(P<0.05),其中L*、b*和Hue在第7～35 d期間無(wú)顯著性變化。a*、C和NH隨著貯藏時(shí)間增加而顯著性降低,b*和Hue的變化無(wú)穩(wěn)定規(guī)律,通常情況下肉類在貯藏過(guò)程中Hue會(huì)因b*的無(wú)規(guī)律變化而無(wú)法得到穩(wěn)定變化趨勢(shì)[23];在冷藏期間水分在第7～21 d貯藏期間無(wú)顯著性變化,在第28～35 d顯著性降低,可能是樣品水樣在儲(chǔ)藏期間有一個(gè)重新平衡的過(guò)程,初期肉樣吸收周圍的水分,含量升高,中后期肉樣發(fā)生部分脫水,水分降低[24]。NaNO2和NH在冷藏期間顯著性降低,亞硝酸鈉與肉中的乳酸反應(yīng)生成亞硝酸,亞硝酸不穩(wěn)定分解成亞硝基,亞硝基進(jìn)一步生成亞硝基肌紅蛋白和亞硝基血紅蛋白[25-26]。pH在貯藏期間變化顯著變化,但是變化趨勢(shì)不穩(wěn)定,后期快速降低可能與樣品中微生物菌相有關(guān)[13]。

2.2 豬肉切片冷藏期間生物胺和游離氨基酸的變化

食品中微生物的活動(dòng)產(chǎn)生的脫羧酶催化氨基酸脫羧產(chǎn)生生物胺,不同的食品和微生物的存在狀態(tài)也會(huì)造成不同胺的產(chǎn)生量的不同[27],因此,有些學(xué)者將生物胺作為判斷食品腐敗的指標(biāo)[28]。從表2中可以看出,8種生物胺和游離氨基酸在冷藏期間,色胺(TRY)、苯乙胺(PHE)、尸胺(CAD)和游離氨基酸總和(∑FAA)整體上無(wú)顯著性變化(P<0.05),本實(shí)驗(yàn)中1～28 d未檢測(cè)出組胺,在35 d檢測(cè)出組胺,可能是前期組胺含量較低,未檢測(cè)出。第1 d時(shí)，在生物胺中,精胺(SPM)的含量最高,其次是苯乙胺(PHE)、色胺(TRY)、組胺(HIS)和腐胺(PUT),此外還含有少量的尸胺(CAD)、酪胺(TYR)和亞精胺(SPD)。有研究報(bào)道稱在鮮肉中精胺和色胺本身的含量比較高[29-30]。但是本實(shí)驗(yàn)中苯乙胺在1～7 d含量比色胺還高,可能是真空包裝肉制品中的優(yōu)勢(shì)菌為乳酸菌[31],因?yàn)槎鄶?shù)彎曲乳桿菌會(huì)產(chǎn)生β-苯乙胺[32]。食品中生物胺的含量受多種因素影響,如體系中可利用游離氨基酸濃度、微生物脫羧酶的活性、pH、離子強(qiáng)度以及加工貯藏條件[33],這可能是本實(shí)驗(yàn)與其他研究報(bào)道存在差異的主要原因。

表2 豬肉切片冷藏期間生物胺和游離氨基酸的變化(mg/kg)Table 2 Changes of biogenic amines and free amino acids during cold storage of pork slices(mg/kg)

表3 豬肉切片冷藏期間蛋白質(zhì)和脂肪氧化的變化Table 3 Changes of protein and fat oxidation during pork storage

2.3 豬肉切片冷藏期間蛋白質(zhì)和脂肪氧化的變化

從表3中可以看出,在蛋白質(zhì)和脂肪氧化中,除了Pr和IC·OH無(wú)顯著性變化外,其他的都有顯著性變化(P<0.05)。CARB和DV在儲(chǔ)藏期間增加,肌細(xì)胞蛋白很容易受到氧化,主要由脂質(zhì)的過(guò)氧化產(chǎn)生的活性氧和自由基攻擊或由金屬或酶催化反應(yīng)引發(fā),從而導(dǎo)致蛋白功能性質(zhì)和肉品品質(zhì)的變化。SH在冷藏期間減少,SH具有較強(qiáng)的還原力,在冷藏期間脂質(zhì)和蛋白的氧化,體系的氧化力增加,SH含量降低[34]。其中DV和FCARB在冷藏期間的變化趨勢(shì)都是第1～14 d增加,在14～21 d減少。

2.4 豬肉切片冷藏期間色澤與氮的存在形式和氧化狀態(tài)的因子分析

利用SPSS 19.0軟件對(duì)自制的豬肉切片冷藏期間的色澤和一些理化指標(biāo)、生物胺的含量和16種游離氨基酸之和進(jìn)行主成分分析(PCA)。將這些指標(biāo)進(jìn)行主成分分析后,得到3個(gè)公共因子如表4,因子1和因子2對(duì)樣本的方差累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到87.343%,可以反映所有因素包含的信息,因此下面對(duì)因子1和因子2進(jìn)行分析。

表4 因子分析提取主成分解釋的總方差Table 4 Factor analysis extracts the total variance of principal component interpretation

從表5可以看出,因子1(F1)中,與色澤相關(guān)的因子紅度a*、色調(diào)Hue、色飽和度C、亞硝基血色原NH、亞硝酸鈉、水分、巰基SH和游離氨基酸總和∑FAA的系數(shù)絕對(duì)值都在0.90以上,其次是黃度b*、pH和共軛二烯值DV的系數(shù)絕對(duì)值也比較高,分別為0.886、-0.872和-0.825。鮮肉及肉制品色澤受許多因素影響,如肉的pH、色素含量、氧化還原潛力、腌制劑的擴(kuò)散、溫度、水分等[35]。亞硝酸鹽反應(yīng)生成的NO與肌肉中的肌紅蛋白反應(yīng)有關(guān),這一反應(yīng)也與肌肉色澤有關(guān)[27]。由此可以發(fā)現(xiàn)因子1(F1)與色澤內(nèi)環(huán)境和氮的存在形式有密切關(guān)系。因子2(F2)主要由蛋白含量(Pr)、抑制羥基自由基能力(IC·OH)和酪胺(TYR)這3個(gè)指標(biāo)所決定的,這3個(gè)指標(biāo)的旋轉(zhuǎn)成分矩陣值都在0.8以上,其中蛋白含量(Pr)和抑制羥基自由基能力(IC·OH)同豬肉切片的氧化狀態(tài)有關(guān)。F2與豬肉切片的氧化狀態(tài)有關(guān)。

表5 旋轉(zhuǎn)成份矩陣Table 5 Rotation component matrix

從圖1中可以看出,生物胺和游離氨基酸之和在因子1(F1)和因子(F2)平面散點(diǎn)圖上面的分布比較分散,說(shuō)明豬肉切片各類含氮化合物之間可能有關(guān)聯(lián),但不是直接相關(guān)。NH、紅度a*、黃度b*、亮度L、色飽和度C和亞硝酸鈉NaNO2在因子1(F1)的右邊,游離氨基酸總和ΣFAA、pH、水分和色調(diào)Hue在因子1(F1)的左邊,并且紅度a*和這些都與因子1(F1)有密切的關(guān)聯(lián),說(shuō)明因子1(F1)代表了豬肉切片的色澤內(nèi)環(huán)境,并且紅度a*和游離氨基酸總和ΣFAA在F1上面的位置相對(duì),說(shuō)明游離氨基酸總和ΣFAA 直接影響到了豬肉切片儲(chǔ)藏期間的紅度,可能是游離氨基酸總和ΣFAA或者個(gè)別游離氨基酸通過(guò)影響環(huán)境體系的酸堿度,或者通過(guò)影響亮度L*和黃度b*,間接影響表觀紅[13],而且紅度a*和NH兩個(gè)因素之間的相對(duì)距離最近,說(shuō)明NH的變化直接影響到產(chǎn)品表觀紅度,因?yàn)閬喯趸w是非常穩(wěn)定的鮮紅色[6],這與表1表達(dá)的信息是一致的。在因子2(F2)中非蛋白氮(NPN)、抑制羥自由基能力(IC·OH)、蛋白含量(Pr)、和色胺(TYR)上系數(shù)絕對(duì)值比較大,并且抑制羥自由基能力(IC·OH)和蛋白含量(Pr)呈極顯著負(fù)相關(guān),可能是在自由基氧化的攻擊下,蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化,導(dǎo)致疏水集團(tuán)暴露,表面疏水性增加,從而蛋白質(zhì)-水分子的作用力減少,此外,蛋白質(zhì)交聯(lián)形成的聚合物也會(huì)削弱蛋白與溶劑相互作用綜合可以看出F(2)反映出蛋白質(zhì)的氧化情況,羥自由基普遍存在肉制品儲(chǔ)藏過(guò)程中,并且會(huì)進(jìn)一步影響蛋白的氧化。

圖1 旋轉(zhuǎn)空間中的成分圖Fig.1 Composition diagram in the rotating space

3 結(jié)論

腌制蒸煮豬肉切片在冷藏期間褪色顯著,亮度L*、紅度a*、黃度b*、色調(diào)Hue、色飽和度C和亞硝基血色原NH均發(fā)生了顯著性變化,生物胺中酪胺(TYR)、亞精胺(SPD)和精胺(SPM)發(fā)生顯著性變化,游離氨基酸之和在冷藏期間無(wú)顯著性變化;非蛋白氮(NPN)、羰基(CARB)和共軛二烯值(DV)發(fā)生顯著性變化,冷藏期間腌制蒸煮豬肉切片的蛋白質(zhì)和脂肪受到較大影響。通過(guò)因子分析,可以發(fā)現(xiàn),色澤內(nèi)環(huán)境和氮的存在形式有相關(guān)性。其中游離氨基酸之和只跟色調(diào)Hue正相關(guān),與其他色澤指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān);生物胺中,除了色胺(TRY)與亮度L*呈顯著負(fù)相關(guān)外,其他生物胺與色澤無(wú)顯著相關(guān)。