1 天津商業(yè)大學(xué)體衛(wèi)部（天津300134）

2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院臨床藥理中心（北京100029）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是心肌病和冠心病等多種心血管疾病的終末階段。患者運(yùn)動(dòng)能力顯著下降是CHF的重要臨床表現(xiàn)。隨著心血管康復(fù)運(yùn)動(dòng)的不斷發(fā)展，越來越多的臨床研究表明，運(yùn)動(dòng)康復(fù)能夠顯著改善輕、中度心功能不全患者[左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）＞30%]癥狀[1]，但其具體機(jī)制尚未明確。有研究認(rèn)為，自噬參與了心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展過程[2]。也有研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)自噬的激活有助于運(yùn)動(dòng)能力的提高[3]。自噬在心力衰竭患者運(yùn)動(dòng)康復(fù)過程中似乎起到了雙刃劍的作用。因此，研究不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷下，心力衰竭模型動(dòng)物心功能的改善幅度和自噬相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)變化情況，對(duì)于心力衰竭患者運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的選擇和相關(guān)機(jī)制探討均具有重要的臨床價(jià)值。本研究以左冠狀動(dòng)脈前降支（left anteriordescending coronary artery，LAD）結(jié)扎法復(fù)制大鼠CHF模型，觀察運(yùn)動(dòng)療法對(duì)模型動(dòng)物心功能的影響，并從細(xì)胞自噬角度探討其機(jī)制，為CHF 運(yùn)動(dòng)療法的負(fù)荷選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性SD 大鼠40只，體重220 ± 10 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)地點(diǎn)北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)溫度23℃± 2℃，環(huán)境相對(duì)濕度40%± 5%，通風(fēng)良好，12 h 晝夜交替，常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)符合《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

1.1.2 試劑和儀器

戊巴比妥鈉（Sigma公司，分析純）；BCA 法蛋白定量試劑盒、Western-blot 相關(guān)試劑（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）[4]；組織樣本處理所需蛋白酶抑制劑（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Anti-mTOR antibody（abcam，USA.Ab2732）；Anti- mTOR （phospho S2481） antibody [EPR427（N）]（ab137133）；Anti-LC3B antibody （ab48394）；Anti-GAPDH antibody（abcam，USA.ab9485）。

小動(dòng)物呼吸機(jī)（Kent Scientific 325）；十二道自動(dòng)分析心電圖機(jī)（FX-8322）；電子天平（CP225D 型）；小動(dòng)物高分辨率超聲成像系統(tǒng)（ Vevo2100，加拿大VisualSonic公司，30MHz 探頭，固定聚焦深度12.7 mm，配備VIVO STRAIN分析軟件）；圖像分析系統(tǒng)（Olympus）；恒溫水浴系統(tǒng)（Multi Temp Ⅲcooling，Pharmacia Biotech）；蛋白電泳及電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（Bio-RadMiniIII）；振蕩器（HY-5 型）；平板式掃描儀（Umax2100L）；動(dòng)物跑步機(jī)（DB030）。

1.2 造模方法

LAD致CHF大鼠模型的建立方法同課題組前期發(fā)表文章[4]。腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，備皮。呼吸機(jī)參數(shù)為：呼吸頻率80次/min，潮氣量3 ml/kg，吸呼比1∶2。沿第3、4 肋間開口，暴露心臟后，于左心耳邊緣下1 mm 進(jìn)針，行LAD 術(shù)。結(jié)扎后，利多卡因注射液心肌表面給藥1～2 滴，呋塞米注射液腹腔給藥0.1～0.2 ml后逐層關(guān)胸。術(shù)后青霉素注射液腹腔給藥，800萬單位，每日3次，連續(xù)3天。根據(jù)《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》，射血分?jǐn)?shù)＜50%是診斷心力衰竭的重要指標(biāo)之一[6]。本研究在LAD 術(shù)后4周末，行心電圖和超聲心動(dòng)檢查，標(biāo)準(zhǔn)12 導(dǎo)聯(lián)心電圖中出現(xiàn)6～8個(gè)導(dǎo)聯(lián)Q波、且LVEF 30%～50%的32只模型大鼠入選后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組及運(yùn)動(dòng)方案

分組及跑臺(tái)訓(xùn)練方案參照Bedford[5]的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)制定，與本研究前期發(fā)表文章相同[4]。隨機(jī)分為4組，每組8只，具體如下：（1）C+LAD 組為模型對(duì)照組，不疊加運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；（2）模型+低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（LE+LAD）組：70%VO2max：跑臺(tái)坡度3°，30 m/min×12 min/次×3次；（3）模型+中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（ME+LAD）組：80%VO2max：跑臺(tái)坡度6°，32 m/min ×12 min/次×3次；（4）模型+高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（HE +LAD）組：90%VO2max：跑臺(tái)坡度6°，36 m/min×12 min/次×3次。所有運(yùn)動(dòng)組動(dòng)物于術(shù)后第5 周開始運(yùn)動(dòng)，12 min/次，每次間歇30 min，3次/日，每周運(yùn)動(dòng)5 天。所有動(dòng)物于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練開始后第8周末取材。

1.4 超聲心動(dòng)評(píng)價(jià)各組大鼠心功能

為評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠心功能的影響，各組大鼠在接受不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練8 周后進(jìn)行心臟超聲檢查。大鼠超聲檢查采用Vevo 2100 小動(dòng)物高分辨率超聲成像系統(tǒng)（Visualsonics公司，加拿大），大鼠探頭MS-250，頻率30 MHz，固定聚焦深度12.7 mm，數(shù)據(jù)分析采用配套VIVO STRAIN軟件。所有動(dòng)物均空腹?fàn)顟B(tài)檢查，麻醉后左側(cè)臥位，動(dòng)態(tài)圖像觀測與瞬時(shí)停禎結(jié)合，采集二維、M 型及多普勒超聲心動(dòng)圖。檢測左室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和短軸收縮率（fraction shortening，F(xiàn)S），評(píng)價(jià)心肌收縮、舒張功能。

1.5 Western-blot 實(shí)驗(yàn)

方法與課題組前期發(fā)表文章相同[4]。簡述如下，取左心室梗死邊緣區(qū)0.5mm以內(nèi)心肌組織50 mg，提取總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白含量測定后，每孔上樣50 μg，采用濃縮膠5%～7%，分離膠10%或12.5%。電泳條件：100 V，1.5 h。轉(zhuǎn)膜條件：300 mA，1～1.5 h，5%脫脂奶粉4℃封閉1 h。一抗條件：兔抗大鼠雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）多克隆抗體1∶1000；兔抗大鼠磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）單克隆抗體1∶1000；兔抗自噬相關(guān)蛋白LC3B（microtubuleassociated protein light chain 3B，LC3B）多克隆抗體1∶1000；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體1∶1000。孵育過夜后0.1%TBST 漂洗NC 膜3×15 min。二抗條件：辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5000），37℃孵育1.5 h，TBST 漂洗3×15 min。滴加ECL發(fā)光液，曝光。掃描膠片后，使用Image J 軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值，與內(nèi)參（GAPDH）條帶光密度值進(jìn)行比較后，得到目的蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用Spss22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異非常顯著。

2 結(jié)果

2.1 超聲心動(dòng)評(píng)價(jià)結(jié)果

與C+LAD 組比較，ME+LAD 組大鼠FS和EF 均顯著升高（P＜0.01），LE+LAD 組FS 顯著改善（P＜0.05）；ME+LAD 組大鼠FS 值顯著高于HE+LAD 組（P＜0.01），EF值顯著高于HE+LAD組（P＜0.01）。

表1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)后8周心功能比較（n=8，%）

2.2 心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與C+LAD 組比較，LE+LAD 組和ME+LAD 組大鼠心肌組織mTOR 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），ME+LAD 組和HE+LAD 組大鼠心肌組織p-mTOR 表達(dá)降低（P＜0.01），LC3B-Ⅱ表達(dá)升高（P＜0.01）。與LE+LAD 組相比，ME+LAD組和HE+LAD 組大鼠心肌組織p-mTOR表達(dá)降低、LC3B-Ⅱ表達(dá)升高（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

表2 各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白條帶分析結(jié)果

3 討論

心衰是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或晚期階段，死亡率和再住院率居高不下[6]。冠心病導(dǎo)致的心肌缺血是CHF 最主要的誘因。在CHF的臨床治療和康復(fù)過程中，心功能改善程度是判斷治療效果的重要指標(biāo)。國內(nèi)相關(guān)臨床研究表明，運(yùn)動(dòng)療法能通過減輕患者心臟負(fù)荷、降低外周血管阻力，減少心肌耗氧量，增強(qiáng)心肌收縮力，提高心排出量，有效促進(jìn)CHF 患者心功能和生活質(zhì)量的改善[7-9]。國外學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠激活骨骼肌自噬水平，改善心梗大鼠心功能[10]。本研究結(jié)果顯示，與C+LAD 組大鼠心功能相比，不同負(fù)荷訓(xùn)練對(duì)模型動(dòng)物的心功能表現(xiàn)為EF和FS 值的不同程度改善。其中，以ME+LAD 組大鼠EF和FS 值升高最為顯著。上述動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了運(yùn)動(dòng)療法對(duì)心力衰竭動(dòng)物心功能的改善作用。與此同時(shí)，心力衰竭模型的成功復(fù)制為運(yùn)動(dòng)療法的機(jī)制研究提供了可能。為探討運(yùn)動(dòng)療法實(shí)現(xiàn)心功能改善的可能機(jī)制，本研究以心肌細(xì)胞自噬相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)為靶點(diǎn)，進(jìn)行了較為深入的研究。

自噬是真核細(xì)胞通過溶酶體機(jī)制降解自身成分的一種代謝途徑。細(xì)胞通過自噬降解損壞的細(xì)胞器和大分子延長細(xì)胞壽命。依賴于激活的時(shí)間、幅度和細(xì)胞類型，自噬過程在多種心血管疾病中表現(xiàn)出雙重作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，適宜強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)可能會(huì)上調(diào)心肌細(xì)胞自噬水平，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)代謝廢物降解，引起心肌組織細(xì)胞良好的適應(yīng)性重塑，幫助維持心肌細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)[12]。但大強(qiáng)度長時(shí)間的耐力訓(xùn)練可能會(huì)引起心肌細(xì)胞形態(tài)異常，它可能導(dǎo)致線粒體巨變和自噬體增多、細(xì)胞內(nèi)成分過度降解，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，從而形成心肌損傷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[13]。本研究根據(jù)不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷對(duì)心衰模型動(dòng)物進(jìn)行分組訓(xùn)練，希望能夠發(fā)現(xiàn)不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞自噬水平的影響。

mTOR 已被明確為自噬的負(fù)性調(diào)控因子。有研究認(rèn)為，在病理性心肌肥厚形成及心力衰竭進(jìn)展過程中，通過抑制mTOR 信號(hào)通路，阻斷其調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)合成，提高自噬水平，可以減弱心肌肥厚，延緩心力衰竭進(jìn)展[14]。LC3B 也是自噬的關(guān)鍵蛋白，在自噬泡形成過程中參與兩種泛素樣蛋白系統(tǒng)的加工過程，被認(rèn)為是自噬活動(dòng)的特異性標(biāo)志物，缺血區(qū)域周圍的心肌細(xì)胞LC3B-Ⅱ水平的顯著升高也表明了該區(qū)域心肌細(xì)胞自噬的激活[15，16]。Moradi等研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律運(yùn)動(dòng)聯(lián)合飲食控制能夠上調(diào)LC3B-Ⅱ水平，抑制心衰大鼠的左心室重構(gòu)[17]。但目前針對(duì)心衰模型動(dòng)物心肌細(xì)胞自噬水平與不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練之間關(guān)系的研究，尚未見報(bào)道。因此，本研究將上述指標(biāo)相結(jié)合，對(duì)不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌細(xì)胞的自噬水平進(jìn)行判斷。結(jié)果表明，LE+LAD 組的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷程度不足以激活心肌細(xì)胞自噬，ME+LAD 組和HE+LAD 組訓(xùn)練均能夠顯著抑制mTOR 及其磷酸化水平，同時(shí)，LC3B-Ⅱ/GAPDH 水平也發(fā)生了不同程度的提高。可見，中、高負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠激活心衰大鼠心肌細(xì)胞自噬水平，而且運(yùn)動(dòng)負(fù)荷越大，心肌細(xì)胞自噬水平越高。

然而，本研究發(fā)現(xiàn)，自噬激活水平最高的HE+LAD 組大鼠心功能并未得到顯著改善。結(jié)合前期文獻(xiàn)報(bào)道和本課題前期研究結(jié)果[4]分析原因認(rèn)為，高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能導(dǎo)致了心肌細(xì)胞自噬的過度激活，同時(shí)導(dǎo)致了心肌細(xì)胞凋亡水平的升高，而中等負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練則在心肌細(xì)胞的自噬與凋亡之間形成了良好的平衡，從而對(duì)心功能的恢復(fù)起到了積極作用，進(jìn)一步證實(shí)了心衰的運(yùn)動(dòng)康復(fù)過程中運(yùn)動(dòng)負(fù)荷選擇的重要性。

4 結(jié)論

適度運(yùn)動(dòng)能夠改善心力衰竭大鼠心功能，這種心功能的改善可能與抑制mTOR和其磷酸化水平，提高LC3B-Ⅱ水平，適度激活心肌細(xì)胞自噬有關(guān)。