,2,3,*

(1.云南民族大學化學與環(huán)境學院,云南昆明 650500;2.生物基材料綠色制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,云南昆明 650500;3.云南省跨境民族地區(qū)生物質(zhì)資源清潔利用國際聯(lián)合研究中心,云南昆明 650500)

胭脂果又稱山李子,學名粗梗稠李(Padusnapaulensis),俗稱“鬼眼睛果”,胭脂果樹為落葉喬木,葉片多為長橢圓形,開白色的序狀花朵,胭脂果的皮和果肉都為紫色,有特殊香味,現(xiàn)多為野生,國內(nèi)主要生長在云南德宏、保山、鳳慶的部分地區(qū),可以直接鮮食、釀酒或用冰糖水燉,味道爽口,顏色美觀,且具有開胃消食的保健功能,深受當?shù)厝说南矏踇1],除此之外,種子有很高的油量,提取后可用于工業(yè)用油[2]。研究發(fā)現(xiàn)胭脂果中含有豐富的花青素、多糖、有機酸、維生素、鈣、磷和鐵等微量元素和其它化學成分[3]。其中,胭脂果中的多糖是一類重要的生物活性物質(zhì),大量研究報道植物多糖具有抗氧化[4]、降血脂[5]、降血糖[6]、抗腫瘤等一系列重要生物學功能[7-8]。

近年來,已經(jīng)有學者對枸杞多糖[9]、山楂多糖[10]等進行深入研究,表明多糖可作為一種天然抗氧化劑來代替人工合成抗氧化劑,其通過清除體內(nèi)過量自由基以達到抗氧化的目的[11]。目前國內(nèi)外對胭脂果多糖的研究還鮮少報道,本試驗以胭脂果為研究對象,采用單因素實驗和響應面法優(yōu)化超聲輔助的方式提取胭脂多糖,并通過測定胭脂果粗多糖對DPPH·、·OH清除能力和還原力,為胭脂果多糖的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胭脂果(鮮果) 云南盈江縣農(nóng)貿(mào)市場(均來自同一顆胭脂樹),經(jīng)楊青松副教授鑒定為薔薇科稠李屬的植物;DPPH(1,1-di-phenyi-2-picryhydrazyl) 美國Sigma公司;抗壞血酸、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸鹽緩沖溶液、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、鄰苯三酚、無水乙醇、95%乙醇 天津市風船化學試劑科技有限公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

TU-1950型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;SJIA-2012聚能式超聲波細胞粉碎機(功率為50～1500 W可調(diào))、變幅桿超聲換能器、鈦合金變幅桿+Φ20長鈦合金圓柱狀工具頭(直徑29.4 mm,高71.9 mm)、SJIA-10F真空冷凍干燥機 寧波雙嘉儀器有限公司;80-2臺式高速離心機 湖南凱達科學儀器有限公司;電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;水浴鍋 力辰科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將新鮮的胭脂果清洗去核切碎后,于電熱恒溫干燥箱(40 ℃,5 d)進行干燥后,經(jīng)植物粉碎機粉碎后,過40目的篩,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 水提醇沉法提取胭脂果多糖的工藝流程 準確稱取1 g胭脂果粉末→不同液料比→超聲破壁6 min→轉(zhuǎn)移至水浴鍋中浸提→離心(4000 r/min,10 min)→取上清液→Sevage法脫蛋白→濃縮→醇沉→靜置(-4 ℃,12 h)→離心(4000 r/min,10 min)→去上清液→丙酮、乙醚洗滌→真空冷凍干燥(-30 ℃,壓力0.05 MPa,4 h)→粗多糖→稱量。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 超聲功率對胭脂果多糖得率的影響 以液料比40 mL/g,分別在30、60、90、120、150、180 W的功率下超聲6 min后繼續(xù)于80 ℃的水浴鍋中浸提150 min,平行提取3 次,考察超聲功率對胭脂果多糖得率的影響。

1.2.3.2 提取溫度對胭脂果多糖得率的影響 以液料比40 mL/g,固定超聲時間6 min,超聲功率90 W,分別在40、50、60、70、80、90 ℃溫度條件下提取150 min。平行提取3次,考察提取溫度對胭脂果多糖得率的影響。

1.2.3.3 提取時間對胭脂果多糖得率的影響 以液料比40 mL/g,固定超聲時間6 min,超聲功率90 W,提取溫度為80 ℃條件下,分別在30、60、90、120、150、180 min提取。平行提取3次,考察提取時間對胭脂果多糖得率的影響。

1.2.3.4 液料比對胭脂果多糖得率的影響 提取溫度為80 ℃,固定超聲時間6 min,超聲功率90 W的條件下,分別以10、20、30、40、50、60 mL/g的液料比提取150 min。平行提取3次,考察液料比對胭脂果多糖得率的影響。

1.2.4 響應面試驗設(shè)計 選擇超聲功率、提取溫度、液料比為自變量,以得率為響應值,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理,采用Design Expert軟件進行實驗設(shè)計[12],優(yōu)化超聲輔助水提法提取胭脂果多糖工藝,根據(jù)所得設(shè)計結(jié)果進行試驗,并利用試驗結(jié)果進行響應面分析,獲取所需試驗數(shù)據(jù)。根據(jù)CCD設(shè)計原理,設(shè)置以下3個因素與水平設(shè)計如表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平Table 1 Factors and levels of response surface optimization in Box-Behnken design

1.2.5 胭脂果多糖含量的測定及多糖得率的計算 葡萄糖標準曲線的繪制:以干燥至恒重的葡萄糖為標準樣品,采用苯酚-硫酸法[13],采用可紫外可見分光光譜儀在490 nm下測量其吸光度。精確稱取的葡萄糖20 mg,用超純水定容 50 mL,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL,用超純水補至2.0 mL,加入1.0 mL 6%苯酚水溶液后,迅速加入5.0 mL濃硫酸,反應6 min后在冷水浴中冷卻,以蒸餾水作空白對照,以葡萄糖濃度(C)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標,繪制標準曲線,得到擬合線性回歸方程。

再精確稱取0.02 g胭脂果多糖,定容至25 mL,按上述方法測定胭脂果多糖溶液的吸光度A,根據(jù)標準曲線計算胭脂果中多糖含量。

多糖含量(mg/g)=nCV/m×100

式中:n為稀釋倍數(shù);C為從標準曲線上查出的糖質(zhì)量濃度(mg/mL);V為樣品稀釋后的體積(mL);m為樣品的質(zhì)量(g)。

胭脂果多糖得率的計算公式如下:

1.2.6 胭脂果多糖體外抗氧化活性測定

1.2.6.1 胭脂果多糖最大吸收峰的測定 準確稱取胭脂果多糖0.01 g,用蒸餾水溶解,以4000 r/min離心萃取液10 min,靜置后取上清液,備測。備測樣品均用對應的溶劑稀釋50倍,再進行200～800 nm的光譜掃描,得到胭脂果多糖溶液的吸收光譜和最大吸收峰。

1.2.6.2 胭脂果多糖對DPPH·的清除實驗 參考文獻[14-15]的方法:取2 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液與2 mL的DPPH(A=0.7±0.1)乙醇溶液混合均勻,避光靜置20 min,以95%乙醇做空白對照,測其在517 nm處的吸光度A,以VC溶液取代多糖溶液做陽性對照,平行測定3次。

式中:A為不同濃度的胭脂果多糖溶液與95%乙醇混合測得的吸光度;A0為95%乙醇加樣液的吸光度;A1為DPPH與95%乙醇混合溶液的吸光度。

1.2.6.3 胭脂果多糖對·OH的清除實驗 參考文獻[16-17]的方法,取不同質(zhì)量濃度的胭脂果多糖樣品提取液2 mL,依次加入5 mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液各2 mL,混勻后,靜置8 min,再加入5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL,37 ℃水浴條件下反應30 min后,在波長510 nm處測定吸光度,以VC作為陽性對照,平行測定3次。羥基自由基清除能力用下式表示:

式中:Y(%)為羥基自由基清除率;B為樣品吸光度值;B1為以蒸餾水代替樣品的對照吸光度值;B0為以蒸餾水代替樣品和H2O2的吸光度值。

1.2.6.4 胭脂果多糖還原力測定 參考文獻[18-19]的方法,修改如下:取1 mL不同濃度的胭脂果多糖溶液于試管中,依次加入2.5 mL 0.2 mol/L pH6.6磷酸鹽緩沖溶液和1%鐵氰化鉀溶液,混勻,在50 ℃ 條件下水浴20 min,冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,取混合液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液,混勻,在700 nm波長處測定吸光度,相同方法以VC作陽性對照,平行測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 胭脂果多糖含量的測定

精確稱取真空冷凍干燥后的0.02 g胭脂果多糖,用蒸餾水定容至25 mL,按1.2.6的方法測定胭脂果多糖溶液反應后的吸光度A,可得到胭脂果中的多糖含量。圖1為葡萄糖標準曲線得到線性相關(guān)回歸方程Y=1.241x+0.0598,R2=0.9991。

圖1 葡萄糖標準曲線的繪制Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 超聲功率對胭脂果多糖得率的影響

圖2中,在30～90 W范圍內(nèi),胭脂果多糖的得率隨超聲功率的增大而快速上升,隨著超聲功率增大,植物組織結(jié)構(gòu)被破壞,促進多糖大分子物質(zhì)溶出[20]。當超聲功率為90 W時,胭脂果多糖得率達到最大值12.11%。但當功率超過90 W后,得率開始下降,這可能是在提取過程中粗多糖也會隨著超聲功率的增加而被降解[21]。因此,超聲功率控制在90 W左右較為適宜。

圖2 超聲功率對胭脂果多糖得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power on extraction yield

2.3 提取溫度對胭脂果多糖得率的影響

如圖3所示,隨溫度的升高胭脂果多糖的得率也呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢,在60～80 ℃之間得率顯著(P<0.05)提高,80 ℃時達到最大值,此時多糖得率為12.20%。雖然隨著溫度的升高,傳質(zhì)過程加速,體系黏度降低[22],但高溫可能使多糖水解[23],也會影響多糖的生物活性,導致多糖得率下降。因此,提取溫度選在80 ℃左右較為理想。

圖3 提取溫度對胭脂果多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction yield

2.4 提取時間對胭脂果多糖得率的影響

圖4反映了在30～150 min的提取時間范圍內(nèi),胭脂果多糖得率持續(xù)上升,當提取時間達到150 min時,胭脂果多糖得率達到最大值為11.92%;隨后隨著時間延長胭脂果多糖得率呈現(xiàn)飽和趨勢,考慮到提取時間和浸提時間過長可能會破壞多糖的結(jié)構(gòu)[24],因此,提取時間選在150 min左右較為合適。

圖4 提取時間對胭脂果多糖得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on extraction yield

2.5 液料比對胭脂果多糖得率的影響

由圖5可知,隨液料比的增加,多糖得率逐漸增加,當液料比為40 mL/g時出現(xiàn)了峰值,得率為11.79%,隨后下降?？赡苁侨軇┯昧枯^小時,胭脂果中多糖物質(zhì)不能全部轉(zhuǎn)移到水相中,此時得率較低;當溶劑用量逐漸增大時,植物內(nèi)部的細胞和外部溶劑充分接觸,有利于胭脂果多糖物質(zhì)快速溶出[24];而水溶劑用量繼續(xù)增大時,多糖溶出量已達到飽和,此時水溶劑與植物內(nèi)部物質(zhì)分子間相互作用可能已經(jīng)減弱[25],水溶劑用量過大還會使后面的濃縮過程困難,多糖損失增大,此時多糖得率反而降低。因此,選擇40 mL/g左右的液料比較為合適。

圖5 液料比對胭脂果多糖得率的影響Fig.5 Effects of liquid to material ratio on extraction yield

2.6 胭脂果多糖得率的響應面分析

2.6.1 CCD設(shè)計結(jié)果 通過上述提取胭脂果多糖的單因素實驗,可以發(fā)現(xiàn)提取溫度對多糖得率影響最大,其次,超聲有利于胭脂果多糖物質(zhì)的溶出,但大功率的超聲則會產(chǎn)生反作用,而液料比對胭脂果多糖得率的影響較于其他因素也更為明顯。依據(jù)CCD試驗設(shè)計,以超聲功率、提取溫度和液料比3個因素作為自變量A、B、C,胭脂果多糖得率為響應值R,通過Expert 8.1.6分析軟件獲得的試驗方案及其采用該方案獲得的試驗結(jié)果如表2所示。

表2 CCD試驗設(shè)計及試驗結(jié)果Table 2 CCD test design and experimental results

由表2的CCD試驗設(shè)計結(jié)果可知,響應值R多糖得率與各影響因子間的回歸方程為:

多糖得率(%)=12.42+0.41A+1.03B+0.054C+0.082AB-5.000E-003AC+0.13BC-0.92A2-0.88B2-1.57C2

所得模擬方程具有較好的相關(guān)性,模型總決定系數(shù)為R2=0.9934。此外,對回歸模型進行方差分析,結(jié)果如表3所示。

建立模型項P<0.001,具有高度顯著性,失擬項P=0.0562>0.05,無顯著性,由此可見,所建模型適用于提取胭脂果多糖的響應面分析。此外,A、B、A2、B2、C2項的P值均小于0.001,表現(xiàn)出高度顯著性,而C、AB、AC和BC的P值均大于0.05,對指標無顯著影響。由F值可知,3個因素對胭脂果多糖得率的影響有所不同,其程度大小為:提取溫度>超聲功率>液料比。

2.6.2 響應面分析 圖6顯示了超聲功率(A)、提取溫度(B)和液料比(C)3個因素對胭脂果多糖得率的等高線圖(a、c、e)和3D響應面圖(b、d、f)。由圖6a可以看出A和B因素對胭脂果多糖得率的影響,沿著B因素向峰值方向移動,其等高線密度明顯高于沿A因素方向,由對應的3D響應面圖(圖6b)也能看出在A因素方向響應面曲線整體平緩,而沿B因素方向響應面曲線較陡,說明提取溫度對胭脂果多糖得率的影響大于超聲功率。

表3 胭脂果多糖得率回歸方差分析結(jié)果Table 3 Regression variance analysis results of the Padus napaulensis polysaccharide extraction rates

圖6 各因素及其交互作用對胭脂果多糖得率影響的響應面圖Fig.6 Response surface graphs showing the interactions of various factors on Padus napaulensis polysaccharide yield

圖6c和圖6d則顯示A因素和C因素對胭脂果多糖得率的影響。由等高線圖可以看出,沿著C因素向峰值方向移動的等高線密度明顯低于沿A因素方向;同樣,3D響應面圖(圖6d)也可以看出,在A因素方向響應面曲線的坡度大于C因素方向,因此,A因素變化對胭脂果多糖得率的影響要高于C 因素,即相對于液料比,超聲功率的影響更大。

同樣,圖6e和圖6f可以比較B因素和C因素對胭脂果多糖得率的影響。由兩因素沿峰值方向的等高線密度及其3D響應面圖(圖6f)中響應面曲線的陡峭程度可以看出,B、C兩因素的影響也存在較大的差異,相對于液料比,提取溫度對胭脂果多糖得率的影響更大。但兩因素兩兩交互作用的等高線圖稀疏,對響應值的影響不顯著。

通過響應面分析模型對胭脂果多糖得率的條件進行了優(yōu)化分析,預測的最優(yōu)條件是超聲功率為97 W、提取溫度為86 ℃、液料比為40 mL/g,預測的最優(yōu)得率為12.78%。通過實驗檢驗最優(yōu)預測條件下的多糖提取效果,多糖得率與預測值相接近,達到12.55%±0.31%,相差0.23%,說明該響應面法得到的回歸模型有效、可靠。

2.7 胭脂果多糖溶液最大吸收峰的測定

從圖7的紫外可見吸收光譜掃描結(jié)果可以看出,粗多糖溶液的吸收光譜在400～700 nm之間并沒有吸收峰,DPPH溶液在328、517 nm處出現(xiàn)二個較強的特征吸收峰,而胭脂果多糖溶液在280 nm處出現(xiàn)較強的特征吸收峰。所以本實驗選用的胭脂果多糖溶液的最大吸收波長為280 nm,且胭脂果粗多糖的最大吸收峰不會和DPPH·的最大吸收峰產(chǎn)生重疊現(xiàn)象,存在光譜干擾。

圖7 胭脂果多糖溶液和DPPH的UV-Vis吸收光譜圖 Fig.7 UV-Vis absorption spectrum of Padus napaulensis polysaccharide solution and DPPH

2.8 胭脂果多糖的體外抗氧化活性

從圖8可以看出,在0.05～0.8 mg/mL的濃度范圍內(nèi),DPPH·清除率與VC和多糖溶液呈線性關(guān)系。當多糖濃度為0.2 mg/mL時,清除率達79.64%,之后逐漸趨于平緩,胭脂果多糖的IC50為0.0203 mg/mL,優(yōu)于程永學等[26]利用超聲提取山楂葉多糖對DPPH·的清除(濃度為0.3 mg/mL時,DPPH·清除率達65.1%),說明胭脂果多糖具有明顯清除DPPH·的能力,這可能是多糖的羥基具有供氫質(zhì)體能力的結(jié)果[27]。

圖8 胭脂果多糖對DPPH·的清除作用Fig.8 Scavenging effect of polysaccharide from Padus napaulensis on DPPH radical

2.9 胭脂果多糖對·OH 自由基清除能力

由圖9可知,胭脂果多糖和VC清除羥自由基的能力隨著濃度的加大而升高,其最大清除率可以達到29.26%,VC可達到99.16%以樣品的濃度對自由基清除率做圖并進行線性擬合后計算得到胭脂果多糖清除·OH的IC50為1.44 mg/mL,VC的IC50為0.195 mg/mL,兩者比較,VC對·OH的清除能力強于胭脂果多糖,因此反映出胭脂果多糖對羥自由基的清除效果較差。

圖9 胭脂果多糖對·OH 的清除效果Fig.9 Scavenging effect of polysaccharide from Padus napaulensis on hydroxyl radical

2.10 胭脂果多糖還原能力的測定

如圖10所示,在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著胭脂果多糖和抗壞血酸濃度的升高,鐵氰化鉀還原能力越強,抗氧化效果也越好;當胭脂果多糖濃度達到0.8 mg/mL時,最大值為1.32(OD700 nm),優(yōu)于李曉等[28]、于梅等[29]提取的秋葵多糖(濃度為5 mg/mL時的還原力分別為0.724、0.995)。因此,胭脂果多糖的還原能力較強。

圖10 胭脂果多糖的還原力Fig.10 Reducing power of Padus napaulensis polysaccharide

3 結(jié)論

結(jié)合響應面優(yōu)化法,超聲輔助提取胭脂果多糖的最佳工藝為:功率97 W、超聲時間6 min、提取溫度86 ℃、提取時間150 min和液料比40 mL/g,得率可達12.55%±0.31%,與理論預測值接近,說明建立的模型能較好地預測實際得率。胭脂果提取物對DPPH·和·OH清除的IC50分別為0.0203、1.44 mg/mL,且還原能力與胭脂果質(zhì)量濃度呈量效關(guān)系。研究表明,超聲有助于提高胭脂果多糖的得率,提取的多糖具有較好的抗氧化活性,該結(jié)果可為云南特色水果胭脂果在食品工業(yè)中的開發(fā)利用提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。