王加志,李希尚,尹授欽,王興娟,楊東海,李新和

及時(shí)準(zhǔn)確的診斷是防制瘧疾的基礎(chǔ)，按照瘧疾診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 259-2015)，當(dāng)前確診瘧疾病例的方法包括血涂片瘧原蟲(chóng)病原學(xué)檢查(鏡檢)、抗原檢測(cè)(RDT)和核酸檢測(cè)(PCR)等三種方法[1]。為分析三種檢測(cè)方法在基層醫(yī)療單位中應(yīng)用的效果，本文對(duì)2015-2018年騰沖市瘧疾病例和疑似瘧疾病例送檢血樣的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析比較，評(píng)價(jià)鏡檢、RDT和PCR 三種瘧疾診斷方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為基層診斷瘧疾選擇適宜檢測(cè)方法提供參考。

材料與方法

1資料來(lái)源

收集2015-2018年由騰沖市各醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室送檢的發(fā)熱病人血涂片和抗凝血進(jìn)行檢測(cè)。

2試劑與儀器

核酸提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。瘧疾快速診斷卡(以下簡(jiǎn)稱RDT)購(gòu)自廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)股份有限公司。CX21FS1光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。A-100PCR 儀和LG2020D凝膠成像系統(tǒng)為中國(guó)杭州朗基科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

3檢測(cè)方法

3.1鏡檢制作厚、薄血涂片2張，置室溫自然干燥，甲醇固定薄血膜后，用吉氏染液染色，由持WHO鏡檢水平一級(jí)證書(shū)的檢驗(yàn)人員于光學(xué)顯微鏡下鏡檢，厚血膜在油鏡下，檢查100個(gè)視野以上或整個(gè)厚血膜未查見(jiàn)瘧原蟲(chóng)判為陰性，血膜中查到瘧原蟲(chóng)為陽(yáng)性，并根據(jù)薄血膜上瘧原蟲(chóng)形態(tài)特征進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定[2]。

3.2瘧原蟲(chóng)抗原檢測(cè)采用免疫層析技術(shù)檢測(cè)特異性惡性瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶(pfLDH)和瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶(panLDH)，按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取患者外周血5μL，滴加于試劑卡加樣孔A中，同時(shí)滴加4 滴裂解液于加樣孔B中，15 min內(nèi)觀察結(jié)果。

3.3瘧原蟲(chóng)核酸檢測(cè)采用巢式PCR 方法，DNA提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。巢式PCR檢測(cè)瘧原蟲(chóng)種類(lèi)的引物及其擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1，惡性瘧原蟲(chóng)205 bp、間日瘧原蟲(chóng)120 bp、三日瘧原蟲(chóng)141 bp、卵形瘧原蟲(chóng)800 bp。設(shè)反應(yīng)總體系20μL，巢式PCR 第1輪擴(kuò)增體系包括PCR緩沖液2μL、10μmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)1.6μL、10 μmol/L 引物rPLU5和rPLU6 各1.0μL、Taq 酶0.1μL、雙蒸水13.3μL、DNA 模板1.0μL，混勻后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件為:95℃3min，94℃1 min，60℃1 min，72℃2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃6 min。巢式PCR 第2輪擴(kuò)增體系包括PCR緩沖液2 μL、10μmol/L dNTP1.6μL、10μmol/L 引物RVIV1和RVIV2 各0.8μL 或其他4 種瘧原蟲(chóng)特異性上下游各0.8μL、Taq 酶0.1μL、雙蒸水12.7μL、第1輪PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物2.0μL，混勻后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件為:95℃3 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃6 min。同時(shí)設(shè)立空白和陽(yáng)性對(duì)照，空白對(duì)照使用無(wú)菌水，陽(yáng)性對(duì)照使用合成的瘧原蟲(chóng)DNA片段。

4確診病例

以鏡檢、RDT 和PCR 三種方法任意一種檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，且經(jīng)云南省寄生蟲(chóng)病防治所復(fù)核、確認(rèn)一致的陽(yáng)性病例，定為確診病例。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel 2010、SPSS 17.0軟件整理分析數(shù)據(jù)資料，計(jì)算靈敏度、特異度、假陰性率、假陽(yáng)性率、符合率等指標(biāo)。不同檢測(cè)方法與確診結(jié)果比較用Kappa檢驗(yàn)。

結(jié)果

1檢測(cè)樣本數(shù)量及確診結(jié)果

2015-2018年，瘧疾送檢樣本共計(jì)610 份。每份樣本經(jīng)三種方法同時(shí)檢測(cè)，判定為陰性樣本295份(48.36%)，陽(yáng)性樣本315份(51.64%)。其中惡性瘧67份(21.27%)、間日瘧245份(77.78%)；三日瘧1份，混合感染2份。見(jiàn)表2。

2三種瘧疾檢測(cè)方法的檢測(cè)效果

結(jié)果顯示，三種檢測(cè)方法中，PCR 的靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值最高、假陰性率最低。三種方法的特異度、假陽(yáng)性率和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值相同。在總符合率方面，Kappa檢驗(yàn)結(jié)果顯示三種方法均與與確診結(jié)果高度一致(Kappa=0.993、0.957、0.944，P均＜0.001)。其中，對(duì)間日瘧、三日瘧和混合感染檢測(cè)的符合率，以PCR 最高，為100%(246/246)；鏡檢次之，為97.97%(241/246)，其中5例鏡檢陰性，PCR檢測(cè)為間日瘧；RDT 最低，為93.9%(231/246)，其中15例RDT 檢測(cè)陰性，PCR 檢測(cè)為間日瘧14例、三日瘧1例。但對(duì)惡性瘧單一蟲(chóng)種檢測(cè)的符合率，以RDT最高，為100%(67/67)，其中2例RDT 檢測(cè)陽(yáng)性，PCR 和鏡檢均為陰性；PCR 次之，為97.01%(65/67)；鏡檢最低，為88.06%(59/67)。三種檢測(cè)方法的具體檢測(cè)結(jié)果以及評(píng)價(jià)效果詳見(jiàn)表3、表4。

表1巢式PCR 引物和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

表2騰沖市2015-2018年瘧疾樣本檢測(cè)情況

討論

不同方法檢測(cè)結(jié)果表明，敏感性以PCR 最高，鏡檢次之，RDT 最低。對(duì)除惡性瘧以外蟲(chóng)種的鑒定能力，以PCR 最高，鏡檢次之，RDT 最低；但對(duì)于惡性瘧單一蟲(chóng)種的鑒定，則以RDT 最優(yōu)。以PCR 為代表的分子檢測(cè)技術(shù)是鏡檢、RDT 和PCR 等檢測(cè)方法中敏感性最高的，其檢測(cè)靈敏度達(dá)4.4個(gè)原蟲(chóng)/μL 血[3]，同時(shí)，PCR 方法在基因水平進(jìn)行蟲(chóng)種的準(zhǔn)確鑒定，也是特異性最高的檢測(cè)方法。巢式PCR 用于瘧疾的檢測(cè)和蟲(chóng)種鑒定，有利于提高瘧疾的檢出率和準(zhǔn)確性[4]，但由于成本高、操作較復(fù)雜、人員培訓(xùn)難、需特殊儀器及檢測(cè)的快速性等方面受限制，在基層單位實(shí)際應(yīng)用較難推廣。血涂片染色后鏡檢一直被認(rèn)為是瘧疾診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。目前，鏡檢仍是我國(guó)瘧疾診斷的主要方法，其具有操作簡(jiǎn)便、敏感、價(jià)廉和可鑒別蟲(chóng)種等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高，易受主觀因素影響，不同鏡檢人員可能會(huì)得出不一樣的結(jié)果[5]，因此需要經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)人員才能正確鑒定蟲(chóng)種，以避免漏診和誤診。隨著我國(guó)消除瘧疾進(jìn)程的推進(jìn)[6]，基層鏡檢人員檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的機(jī)會(huì)越來(lái)越少，因此想要維持較高的鏡檢能力和水平有較大的挑戰(zhàn)。

本研究結(jié)果顯示，RDT 的靈敏度為94.60%，特異度為100%，且與確診結(jié)果的符合率高達(dá)97.21%，提示RDT 可以檢出絕大部分瘧疾陽(yáng)性病例。對(duì)于RDT 檢測(cè)惡性瘧陽(yáng)性、而PCR 和鏡檢均為陰性的病例，并不一定是假陽(yáng)性。經(jīng)重復(fù)檢測(cè)排除操作或結(jié)果讀取方法不當(dāng)、試劑盒儲(chǔ)存不當(dāng)?shù)纫蛩赝?，可能是因?yàn)橛行┎±委熀?，盡管血中原蟲(chóng)被清除，但pfLDH仍會(huì)在患者體內(nèi)殘存一段時(shí)間[7]。因此，RDT 檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)感染樣本較PCR 和鏡檢的敏感性可能更高，與江莉等[8]研究相似。同時(shí)，RDT

表3三種檢測(cè)方法與確診病例的檢測(cè)結(jié)果比較

表4三種檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)指標(biāo)結(jié)果

檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，即使非專(zhuān)業(yè)人員按照說(shuō)明書(shū)也可進(jìn)行操作，15 min內(nèi)觀察結(jié)果，結(jié)果讀取快速準(zhǔn)確，不需要特殊儀器設(shè)備，成本亦較低，基層醫(yī)療衛(wèi)生單位使用，可有效提高基層瘧疾診斷能力[9]，因此適宜現(xiàn)場(chǎng)和基層人員使用[10]。但需注意不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的RDT 質(zhì)量可能不同，其敏感性和特異性亦有較大差異，本研究?jī)H選用了廣州萬(wàn)孚的試劑盒，未與其他檢測(cè)試劑盒相對(duì)照，RDT 檢測(cè)結(jié)果僅代表此試劑盒的檢測(cè)結(jié)果。