張世清, 章樂生, 汪峰峰, 汪天平

血吸蟲病是世界衛(wèi)生組織確定的六大重點熱帶病之一，也是嚴(yán)重威脅我國人民身體健康和阻礙經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的重大傳染病。 間接紅細(xì)胞凝集試驗(以下簡稱“IHA”)作為一種經(jīng)典的血吸蟲病免疫學(xué)診斷方法，較早應(yīng)用于我國血吸蟲病流行區(qū)人群查病工作[1，2]。 憑借其較高的敏感性以及技術(shù)成熟、操作便捷、價格低廉等特點[3-5]，在安徽、湖南、湖北、江西、云南、浙江等血吸蟲病流行省份，IHA 方法普遍應(yīng)用于疫區(qū)人群血吸蟲病篩查，目前已占全國篩查人群的70%以上，為當(dāng)前我國血吸蟲病現(xiàn)場人群查病的主要方法[6]。 但是，IHA 方法在現(xiàn)場應(yīng)用時也存在一定的不足之處。 因其方法為半定量，且對結(jié)果判斷需肉眼觀察，存在一定的主觀性[6]。原衛(wèi)生部于2006 年曾發(fā)布《血吸蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS261-2006)，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了血吸蟲病的診斷依據(jù)、診斷原則、診斷標(biāo)準(zhǔn)和鑒別診斷，但目前尚無日本血吸蟲抗體檢測(間接紅細(xì)胞凝集試驗)技術(shù)規(guī)范文獻(xiàn)。 作為目前我國血吸蟲病主要診斷方法，缺乏統(tǒng)一規(guī)范的操作規(guī)程和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，不同地區(qū)、不同技術(shù)人員開展血吸蟲病檢測時，結(jié)果存在一定差異，亦影響了檢測結(jié)果的質(zhì)量、可信度和可比性。 因此，迫切需要建立一套標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程和判斷方法，以確保結(jié)果的可比性和準(zhǔn)確性，同時對我國當(dāng)前血吸蟲病診斷網(wǎng)絡(luò)實驗室建設(shè)也具有指導(dǎo)作用。 本標(biāo)準(zhǔn)的制定旨在通過規(guī)范日本血吸蟲抗體檢測(間接紅細(xì)胞凝集試驗)操作方法、結(jié)果判定、應(yīng)用范圍以及注意事項等，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性，減小漏判和誤判，以適應(yīng)臨床診斷和現(xiàn)場防治工作的需求。

1 標(biāo)準(zhǔn)編制過程與方法

本標(biāo)準(zhǔn)是受原國家衛(wèi)生與計劃生育委員會政策法規(guī)司委托，安徽省血吸蟲病防治研究所、中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所、浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所、江蘇省血吸蟲病防治研究所、江西省寄生蟲病防治研究所等單位有關(guān)專家共同編制。 在編制過程中先后召開2 次專家研討會，并函請全國從事寄生蟲病預(yù)防控制、臨床、教學(xué)、科研等單位的21 位專家征求意見。 21 位專家來自安徽、江蘇、湖南、湖北、江西、云南、四川、上海、廣東等省份，涵括了目前我國血吸蟲病重點流行省份。 本標(biāo)準(zhǔn)從起草至形成標(biāo)準(zhǔn)報批稿過程中，起草組對收到的102 條專家反饋意見進(jìn)行逐項研究討論，其中采納38 條，部分采納15 條，未采納49 條。 在征集整理函審專家的意見過程中，函審專家對本標(biāo)準(zhǔn)中采集樣本的放置時間和血清分離相對離心力的確定、試劑盒從冷藏儲存環(huán)境取出后平衡時間、致敏紅細(xì)胞懸液配制后放置不同時間對于結(jié)果的影響、觀察結(jié)果的最佳控制時間等4 個關(guān)鍵指標(biāo)關(guān)注點比較集中，本標(biāo)準(zhǔn)編制專家工作組對4 個指標(biāo)分別進(jìn)行了現(xiàn)場驗證與評價，根據(jù)現(xiàn)場驗證結(jié)果，討論并修訂該指標(biāo)的相關(guān)參數(shù)。 標(biāo)準(zhǔn)編制過程中采用查詢文獻(xiàn)資料、現(xiàn)場調(diào)研及驗證等方式，并廣泛征求疾病預(yù)防控制中心、寄生蟲病防治研究所以及高等院校等各領(lǐng)域?qū)＜业囊庖?，確保標(biāo)準(zhǔn)的實用性和科學(xué)性。 本標(biāo)準(zhǔn)的編制參考了《血吸蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 261-2006)、《血吸蟲病控制和消除》(GB 15976-2015)、《血吸蟲病防治手冊》(第三版)等文獻(xiàn)，遵循《衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》相關(guān)規(guī)定并按照《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則》(GBT 1.1-2009)的體例和寫作方式進(jìn)行編制，最終形成了《日本血吸蟲抗體檢測 間接紅細(xì)胞凝集試驗》(WS/T 630-2018)衛(wèi)生行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)，并由中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會于2018 年9 月26 日發(fā)布，2019 年4 月1 日實施。

2 標(biāo)準(zhǔn)的正文內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)為衛(wèi)生行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)。 正文由六個部分組成，包括標(biāo)準(zhǔn)適用范圍、術(shù)語和定義、所需儀器設(shè)備、試劑材料、檢測步驟和結(jié)果判定依據(jù)。 另外，標(biāo)準(zhǔn)附有三個資料性附錄，詳細(xì)介紹了標(biāo)準(zhǔn)中涉及到的主要試劑材料的制備方法、操作程序以及結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn)。 本標(biāo)準(zhǔn)的制定，充分考慮了我國各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)實驗室的設(shè)施設(shè)備，適合我國日本血吸蟲抗體檢測工作的實際需要，為我國血吸蟲病防治和臨床輔助診斷提供可靠的技術(shù)保障。 其主要內(nèi)容包括:

2.1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了間接紅細(xì)胞凝集試驗檢測日本血吸蟲抗體的技術(shù)規(guī)范，適用于各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)對日本血吸蟲抗體的檢測。

2.2 術(shù)語和定義 本標(biāo)準(zhǔn)明確了血吸蟲病、間接紅細(xì)胞凝集試驗、可溶性蟲卵抗原的定義，并進(jìn)行了科學(xué)解釋。

2.2.1 血吸蟲病 由血吸蟲寄生于人和其他哺乳動物所引起的疾病，在我國特指日本血吸蟲病。

2.2.2 間接紅細(xì)胞凝集試驗 將抗原包被于紅細(xì)胞表面，成為致敏的載體，然后與相應(yīng)的抗體結(jié)合，通過抗體橋聯(lián)，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，以檢測樣本中的相應(yīng)抗體。 最常用的紅細(xì)胞為健康人“O”型紅細(xì)胞。

2.2.3 可溶性蟲卵抗原 血吸蟲蟲卵經(jīng)勻漿和超聲破碎等處理后離心收集的上清液，含蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖等多種成分復(fù)合物。

2.3 儀器設(shè)備 本標(biāo)準(zhǔn)對采用間接紅細(xì)胞凝集試驗檢測日本血吸蟲抗體必要的儀器設(shè)備及技術(shù)參數(shù)提出了要求，其必要的儀器設(shè)備應(yīng)包括臺式低速離心機(jī)、平板微量振蕩器、電熱恒溫水浴箱、微量移液器等，也為進(jìn)一步規(guī)范血吸蟲病診斷網(wǎng)絡(luò)實驗室建設(shè)提供了參考依據(jù)。 其中臺式低速離心機(jī)技術(shù)參數(shù)要求最高轉(zhuǎn)速≥2 500 r/min，或最大相對離心力≥800 g；平板微量振蕩器技術(shù)參數(shù)要求最高振動頻率2 800 r/min，最大振幅6 mm；電熱恒溫水浴箱技術(shù)參數(shù)要求控溫范圍室溫+5 ℃～99.9 ℃，溫度分辨率/波動度0.1 ℃/±0.5 ℃；微量移液器技術(shù)參數(shù)要求量程范圍10～100 μL，增量1 μL；量程范圍100 ～1 000 μL，增量5 μL。

2.4 試劑材料 本標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定了“日本血吸蟲抗體檢測 間接紅細(xì)胞凝集試驗”主要試劑材料及技術(shù)參數(shù)。 試劑材料中除凍干致敏紅細(xì)胞以外，強(qiáng)調(diào)應(yīng)同時配置陽性對照血清和陰性對照血清，以確保試驗結(jié)果的可靠性。 其中凍干致敏紅細(xì)胞的主要組成成分為日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原、健康人“O”型紅細(xì)胞和蔗糖，陽性對照血清的來源為感染日本血吸蟲的兔混合血清，陰性對照血清的來源為正常兔混合血清。 此外，也是首次明確要求將pH7.2 磷酸鹽緩沖液(PBS)作為稀釋液。 為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，本標(biāo)準(zhǔn)推薦使用“V”型微孔有機(jī)玻璃血凝板作為血凝反應(yīng)板。

2.5 檢測步驟 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了“日本血吸蟲抗體檢測 間接紅細(xì)胞凝集試驗”的操作規(guī)程及技術(shù)規(guī)范要求。 此外，本標(biāo)準(zhǔn)通過現(xiàn)場驗證，進(jìn)一步明確了檢測過程中涉及的采集樣本的放置時間、試劑盒從冷藏儲存環(huán)境取出后平衡時間、致敏紅細(xì)胞懸液配制后放置時間、觀察結(jié)果的最佳控制時間等關(guān)鍵指標(biāo)要求。

2.5.1 樣本準(zhǔn)備 明確檢測樣本為血清，可通過采集末梢血或靜脈血的方式，室溫下放置至血塊收縮后或離心分離出血清。

2.5.2 樣本檢測 在廣泛征集血防區(qū)相關(guān)省、市、縣等各級血防機(jī)構(gòu)專家意見的基礎(chǔ)上，對“日本血吸蟲抗體檢測 間接紅細(xì)胞凝集試驗”操作步驟進(jìn)行了明確規(guī)定，統(tǒng)一了操作規(guī)程。 在待檢樣本準(zhǔn)備好之后，樣本檢測過程依次按照樣本編號、溶解陽性對照及陰性對照血清、滴加稀釋液、倍比稀釋待檢血清以及陽性和陰性對照血清、稀釋凍干致敏紅細(xì)胞、血清稀釋孔滴加致敏紅細(xì)胞懸液、觀察結(jié)果等操作步驟。 本標(biāo)準(zhǔn)在征集專家意見的基礎(chǔ)上，對血清樣本稀釋、致敏紅細(xì)胞懸液加入方法以及觀察結(jié)果的條件進(jìn)行了統(tǒng)一。

2.6 結(jié)果判定 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，以效價≥1 ∶10 作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定只有在陰性對照血清不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，陽性對照血清出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，檢測結(jié)果才視為有效。

3 標(biāo)準(zhǔn)的附錄內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)有3 個資料性附錄，分別對主要試劑材料的制備方法、各個操作流程的注意事項以及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了詳盡的描述。

附錄A 為主要試劑材料制備方法。 本附錄對凍干致敏紅細(xì)胞、陽性對照血清、陰性對照血清以及稀釋液等主要試劑材料的制備方法進(jìn)行了較為詳細(xì)的描述。 為保證主要試劑材料的質(zhì)量，本標(biāo)準(zhǔn)對其技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了明確規(guī)定，其中凍干致敏紅細(xì)胞要求外觀為褐色或淡紅色疏松體，陽性對照血清檢測效價不低于1 ∶640；陰性對照血清檢測效價不高于1 ∶5；稀釋液為pH 7.2 磷酸鹽緩沖液。

附錄B 為操作程序。 本附錄對“日本血吸蟲抗體檢測 間接紅細(xì)胞凝集試驗”操作各個流程的注意事項進(jìn)行了詳盡的說明，包括采樣及樣本保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、反應(yīng)條件、觀察結(jié)果等。 如血樣采集后要求在4 h 內(nèi)進(jìn)行血清分離，待檢血清量不少于25 μL，如果采集樣本不能及時檢測應(yīng)置于-20℃以下冷凍條件下進(jìn)行長時間保存；檢測試劑應(yīng)放在室溫條件下平衡30 min 以上再行使用；紅細(xì)胞懸液使用前需充分混勻；結(jié)果觀察應(yīng)在10 min 內(nèi)完成等，否則將影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。 尤其是本附錄中依據(jù)操作流程首次制作了標(biāo)準(zhǔn)操作流程示意圖，便于本標(biāo)準(zhǔn)的宣貫及現(xiàn)場推廣應(yīng)用。

附錄C 為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。 本附錄對“日本血吸蟲抗體檢測 間接紅細(xì)胞凝集試驗”陽性和陰性結(jié)果的判定方法和依據(jù)進(jìn)行規(guī)定，對凝集反應(yīng)的特征進(jìn)行了描述，并根據(jù)反應(yīng)強(qiáng)度的特點制作了不同反應(yīng)強(qiáng)度模式圖。

4 標(biāo)準(zhǔn)施行和宣貫重點

IHA 是迄今為止在我國血吸蟲病流行區(qū)應(yīng)用時間最長、使用范圍最廣、檢測人數(shù)最多的免疫學(xué)診斷方法。 但各基層血吸蟲病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)在實際應(yīng)用過程中，依然存在諸多問題。 為了充分發(fā)揮該方法在我國消除血吸蟲病過程中的作用，加快推進(jìn)我國消除血吸蟲病進(jìn)程，應(yīng)加強(qiáng)對本標(biāo)準(zhǔn)宣傳貫徹的力度，進(jìn)一步規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)的實施。 為此，在本標(biāo)準(zhǔn)的施行及宣貫工作中應(yīng)重點把握以下幾點:① 樣本采集過程中，有的地區(qū)采用聚乙烯塑料管采集末梢(耳垂或手指)血，待血液凝固后離心分離血清，后用剪刀將凝固的血塊部分剪去保留血清部分。 在此過程中，需注意剪刀在剪去凝固血塊后，需用酒精棉球?qū)⒓舻稓堄嘌獫n擦除并進(jìn)行消毒，再用干棉球擦干后方可繼續(xù)使用，避免出現(xiàn)交叉污染現(xiàn)象。 ② 本標(biāo)準(zhǔn)“試劑材料”中推薦使用96 孔“V”型有機(jī)玻璃板，并在附錄部分特別強(qiáng)調(diào)有機(jī)玻璃板在使用后需及時清洗。 在操作過程中，使用96 孔“V”型有機(jī)玻璃板觀察結(jié)果后，如不及時進(jìn)行清洗，紅細(xì)胞和血清中蛋白等物質(zhì)易在孔底沉淀并牢固附著于孔底表面，再次使用有機(jī)板時，會對結(jié)果產(chǎn)生影響。 ③在實際操作過程中，應(yīng)嚴(yán)格按照操作步驟示意圖進(jìn)行實驗操作，不宜改動相關(guān)步驟。 為便于現(xiàn)場檢驗人員操作，本標(biāo)準(zhǔn)在附錄B 中添加了操作步驟示意圖，使得間接紅細(xì)胞凝集試驗方法簡單化、條理化。 但在現(xiàn)場驗證過程中，時常發(fā)現(xiàn)現(xiàn)場檢驗人員仍按照以前操作流程，沒有完全按照本標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，如將“凍干致敏紅細(xì)胞稀釋”過程放在“待測樣本稀釋”過程之前。 血清樣本尚未稀釋，就將凍干致敏紅細(xì)胞進(jìn)行稀釋，會導(dǎo)致紅細(xì)胞懸液在后期出現(xiàn)紅細(xì)胞沉淀于瓶底且不易混勻，在最后滴加紅細(xì)胞懸液時出現(xiàn)紅細(xì)胞濃度不均現(xiàn)象，進(jìn)而影響檢測結(jié)果及結(jié)果判斷。

本標(biāo)準(zhǔn)從儀器設(shè)備、試劑材料、檢測步驟、結(jié)果判斷以及操作注意事項等方面作了詳盡的介紹，以期指導(dǎo)檢驗人員在操作過程中能夠做到操作的一致性，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，并克服或減少本方法所存在的主觀判斷所帶來的缺陷。 各地在實際工作過程中運用間接血凝方法檢測血吸蟲抗體所存在的相關(guān)細(xì)節(jié)不同，為此，在做好本標(biāo)準(zhǔn)宣貫的同時，應(yīng)廣泛開展本標(biāo)準(zhǔn)操作的技能培訓(xùn)，使各使用部門以及相關(guān)實驗室檢測人員，能夠了解并掌握本標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)內(nèi)容和條款，熟練運用間接血凝方法檢測血吸蟲抗體。各級血吸蟲病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)將本檢測方法作為血吸蟲病診斷網(wǎng)絡(luò)實驗室考核評估的重要內(nèi)容。