孫葳

菌種是我國重要的生物資源，保藏適當?shù)木N需要正確的活化方法來獲得純培養(yǎng)物，本文結(jié)合多年從事食品微生物檢驗的工作經(jīng)歷，簡要介紹常規(guī)的菌種活化操作方法。

菌種活化就是將保藏狀態(tài)的微生物菌種放入適合其生長繁殖的的培養(yǎng)物中進行培養(yǎng)，通過逐級擴大培養(yǎng)進而獲得活力旺盛、數(shù)量足夠的純培養(yǎng)物。通常我們工作中使用的工作菌種需經(jīng)過要2-3代的復(fù)壯過程，因為菌種的保存條件以及培養(yǎng)條件不盡相同，所以需要活化讓菌種逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境[1]。

一般菌種臨時存放及活化方法

采用低溫保存管保存菌種，應(yīng)存放于-20℃ ～ -80℃的低溫條件下。準備36±1℃的70-75﹪酒精浴槽（若以水浴取代，應(yīng)確保所用水中微生物污染得到控制），事先應(yīng)在浴槽放置小試管架或保存管架等，液面要低于管塞或管蓋。將低溫保存管從低溫保存條件中取出，置于36±1℃的浴槽內(nèi)的管架上。不斷輕微搖動低溫保存管，液面不可高至管塞，直至冰完全溶解（大概需要2min左右）。

無菌培養(yǎng)操作方法

用無菌微量吸管，從已溶解的低溫保存管中吸取1-2滴菌液，滴入指定的固態(tài)培養(yǎng)基一邊緣附近，以劃線或涂布法接種于培養(yǎng)基。也可用滅菌金屬環(huán)蘸取菌液后，以劃線或涂布法接種于培養(yǎng)基。

待菌液吸收完全后，將接種好的培養(yǎng)基倒置放于指定溫度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

平板劃線分離操作方法

平板劃線分離法是指把混雜在一起的微生物用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線稀釋，經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當作待分離微生物的純種。有時這種單菌落并非都由單個細胞繁殖而來的，所以要反復(fù)分離多次才可得到純菌種。

手持金屬接種環(huán)，將接種環(huán)（共約5公分）置于酒精燈外焰燒至火紅，并不斷來回燒烤金屬固定桿之前約10公分，等待幾秒鐘后，將接種環(huán)前端輕觸培養(yǎng)基邊緣凝膠，待接種環(huán)徹底冷卻后，沾黏菌滴，由培養(yǎng)基邊緣向中央輕輕橫劃，直到涵蓋1/3培養(yǎng)基為止。

灼燒接種環(huán)，冷卻后，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)基自1區(qū)涂布的邊緣再橫劃數(shù)條線到未接種的區(qū)域。

重復(fù)2的動作完成。

灼燒接種環(huán)，將接種環(huán)歸位。

一般操作過程

以無菌操作，用無菌微量吸管，從已溶解的管中吸取50μL（或1-2滴）的菌液，滴入固態(tài)指定培養(yǎng)基某一邊緣附近，以劃線法接種于培養(yǎng)基。

將接種好的培養(yǎng)基置于指定溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

對于常規(guī)細菌應(yīng)用無菌吸管，吸取0.3-0.5mL指定的液體培養(yǎng)基，滴入內(nèi)管中，并輕微震蕩（也可用該吸管反復(fù)吹打協(xié)助），直至均勻懸浮。

對于霉菌、酵母菌應(yīng)用無菌吸管，吸取0.3-0.5mL無菌水，滴入內(nèi)管中，待干燥粉末溶解后，以無菌吸管吸取并滴入約含有5mL無菌水的小試管內(nèi)，輕微震蕩均勻后，靜置30-60min。

取0.1-0.2mL菌體懸浮液滴于平板培養(yǎng)基上，劃線分離培養(yǎng)或做成一系列的稀釋，用無菌L棒均勻涂布，檢驗菌種的純度及活化情況，剩余的菌液則全部移入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基內(nèi)，按指定的溫度進行培養(yǎng)。

某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后，遲滯期可能較長，必須培養(yǎng)二倍時間后才可長出，且再經(jīng)過一、二次繼代培養(yǎng)后才能正常生長。若經(jīng)以上方法處理后仍培養(yǎng)失敗，則視為不能活化。

參考文獻：

[1]陳麗湘.凍干菌種復(fù)活、保藏方法探討.蛇志[J].2007，19，1.

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