林濤 蔡錦玲 鄭凱玲

摘要 創(chuàng)建可以同時(shí)檢測番茄抗黃化曲葉病毒病Ty-2基因和抗晚疫病Ph-3基因分子標(biāo)記的多重PCR體系，以快速準(zhǔn)確地鑒定篩選到目標(biāo)基因型。采用多重PCR結(jié)合CAPS技術(shù)，同時(shí)加入2對(duì)引物T0302和TG328，進(jìn)行擴(kuò)增及酶切反應(yīng)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得不同基因型相應(yīng)的帶型，從而建立多重PCR及產(chǎn)物酶切體系，優(yōu)化此體系后再進(jìn)行驗(yàn)證與應(yīng)用。該多重PCR體系可靠高效，顯示共有9種帶型對(duì)應(yīng)Ty-2和Ph-3基因相應(yīng)的基因型，與采用單引物普通PCR技術(shù)分別鑒定的基因型結(jié)果一致，可以用于番茄分子標(biāo)記輔助育種。

關(guān)鍵詞 番茄;多重PCR;CAPS;分子標(biāo)記

中圖分類號(hào) S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）03-0101-04

Abstract We established a multiplex PCR system to identify Ty2 and Ph3 resistance genes of tomato simultaneously，for rapid and accurate identification and screening of target genotype.Multiplex PCRCAPS technology was used to amplify and react with two pairs of primers T0302 and TG328.2%agarosegel electrophoresis was used to detect the corresponding bands to differentiate the genotype of the identified materials，and to establish multiplex PCR system.The results showed that there were 9 kinds of bands corresponding to the genotypes，which were consistent with the genotype identified by single primer PCR.The multiplexPCR systems are reliable and efficient，it could be very useful for markerassisted selection during early stage in tomato and speed up breeding procedure.

Key words Tomato;Multiple PCR;CAPS;Molecular marker

近年來，番茄黃化曲葉病毒病在我國廣西到山東沿海省份，以及云南、山西、新疆、河南、安徽、河北等番茄主產(chǎn)區(qū)均有暴發(fā)[1]。番茄晚疫病是致病疫霉菌侵染所致，一旦暴發(fā)常導(dǎo)致減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)，是一種番茄的毀滅性病害[2]。番茄黃化曲葉病毒病和晚疫病已成為高溫多濕番茄產(chǎn)區(qū)抗病育種的主攻方向之一?？共⌒缘蔫b定受到發(fā)病條件、植株生理狀況、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等影響，提高選擇效率是創(chuàng)制和篩選鑒定番茄育種新材料的關(guān)鍵。借助分子標(biāo)記技術(shù)可以對(duì)育種材料進(jìn)行早期、高效的選擇，加速品種選育與改良的進(jìn)程[3]。

目前已經(jīng)在番茄中發(fā)現(xiàn)的抗TYLCV 的基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4 和Ty-5，其中抗性基因Ty-1和Ty-3為等位基因[4]。Ty-2 基因是源于多毛番茄的單個(gè)顯性基因，Garcia等[5]開發(fā)了與Ty-2緊密連鎖的共顯性SCAR 標(biāo)記T0302。番茄晚疫病抗性受兩類不同的基因控制，一類是單基因控制的質(zhì)量性狀，包括完全顯性基因Ph-1，不安全顯性基因Ph-2和Ph-3，它們均來自醋栗番茄;另一類是多基因控制的數(shù)量性狀，其抗病性與環(huán)境、植株長勢等多種因素有關(guān)[6]。Ph-3基因是番茄抗晚疫病育種中分子標(biāo)記輔助選擇常用的一個(gè)基因[7-10]。孔凡慧[11]的研究表明，標(biāo)記TG328特異性引物可以很好地區(qū)分含番茄晚疫病抗性基因Ph-3的純合抗性材料、雜合抗病材料和不含Ph-3的感病材料，可以應(yīng)用于番茄抗晚疫病種質(zhì)資源的輔助選擇。然而在大中果型番茄種質(zhì)中，抗黃化曲葉病毒病的材料基本上為含Ty-1基因，而含純合Ty-2或Ph-3抗性基因的材料很少。陳寶玲等[12]研究選用的56份大、中果型番茄材料，含雜合抗性基因Ty-2 的材料僅1 份;含純合晚疫病抗性基因Ph-3的材料只有1 份，雜合6 份。多重PCR是在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段，與普通PCR 相比有高效和低成本的優(yōu)勢[13]。國內(nèi)利用多重PCR 技術(shù)對(duì)番茄抗性基因進(jìn)行鑒定已有一定的研究，但能同時(shí)鑒定Ty-2和Ph-3基因的多重PCR體系尚未見報(bào)道[14-16]。

該研究利用共顯性分子標(biāo)記Ty-2基因的SCAR的引物T0302和Ph-3基因的CAPS標(biāo)記的引物TG328，結(jié)合多重PCR和CAPS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，從已知基因型的番茄材料中，獲得不同基因型相應(yīng)的帶型，建立和優(yōu)化可以同時(shí)檢測這2個(gè)抗病基因分子標(biāo)記的多重PCR體系，采用此技術(shù)通過酶切產(chǎn)物的帶型來區(qū)別篩選目標(biāo)材料的基因型。該研究增加了番茄黃化曲葉病毒病和晚疫病快速分子標(biāo)記的鑒定手段，可促進(jìn)抗性基因Ty-2和Ph-3的轉(zhuǎn)育聚合，尤其在創(chuàng)制大果型番茄育種新材料及復(fù)合多抗品種分子標(biāo)記輔助選育中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

多重PCR技術(shù)建立與優(yōu)化試驗(yàn)所用番茄材料（編號(hào)1～9，A為CK1和B為CK2）來自泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，已經(jīng)田間病害鑒定過，單引物普通PCR已分別鑒定了Ty-2和Ph-3抗性基因的基因型。由表1可知，材料1～3號(hào)感番茄TY2（ty-2/ty-2基因型）;4～6號(hào)材料為純合Ty-2基因型，表現(xiàn)為抗番茄TY2;7～9號(hào)為雜合Ty-2基因型;其中2、5和8號(hào)含雜合Ph-3抗性基因，3、6和9號(hào)含純合Ph-3基因型，而1、4、7號(hào)不含抗性基因Ph-3。CK1基因型為Ty-2/Ty-2和Ph-3/Ph-3，作雙抗對(duì)照，CK2 則為雙感對(duì)照。

1.2 DNA的提取與引物設(shè)計(jì)

采用改良的CTAB 法[17]，提取試驗(yàn)DNA后貯存在-20 ℃的冰箱中備用。參照Garcia 等[5]開發(fā)的共顯性SCAR 標(biāo)記T0302設(shè)計(jì)Ty-2基因標(biāo)記的引物序列，Ph-3基因的共顯性CAPS標(biāo)記TG328參照文獻(xiàn)[7]的設(shè)計(jì)，所用標(biāo)記的引物序列見表2，引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技公司合成。

1.3 多重PCR 體系的建立與優(yōu)化

采用多重PCR結(jié)合CAPS技術(shù)，同時(shí)加入2對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增后，再進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物CAPS的酶切反應(yīng)，獲得表1中番茄材料已知抗性基因Ty-2和Ph-3基因型組合所對(duì)應(yīng)的帶型，然后進(jìn)一步優(yōu)化該多重PCR及產(chǎn)物酶切體系。

PCR 反應(yīng)體系20 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye） 10 μL，2對(duì)引物的正反引物（10 μmol/μL）各0.4 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。

1.4 多重PCR體系的驗(yàn)證與應(yīng)用

采用經(jīng)優(yōu)化過的多重PCR 體系對(duì)泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所的24 份番茄材料（編號(hào)801～824）進(jìn)行基因型鑒定應(yīng)用，即通過多重PCR酶切產(chǎn)物帶型區(qū)別判斷其相應(yīng)的基因型，再與使用單引物普通PCR擴(kuò)增的特異性標(biāo)記片段分別進(jìn)行分析比對(duì)，以驗(yàn)證該多重PCR技術(shù)。

Ty-2基因單引物擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為20 μL：10×PCR Buffer 2.0 μL（含Mg2+），dNTP（各2.5 mmol/μL）0.4 μL，正反引物（10 μmol/μL）各0.4 μL，DNA 模板1.0 μL，easyTaq 酶（5 U/μL）0.1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

Ph-3基因單引物擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系同Ty-2基因，PCR 擴(kuò)增程序退火溫度為58 ℃，72 ℃延伸30 s，其他條件相同;酶切體系25 μL：2.2 μL ddH2O， 10×Buffer 2.5 μL，MvaI （BstNI） 酶（10 U/μL） 0.3 μL，混合后加到20 μL PCR產(chǎn)物中，水浴溫度37 ℃條件下，酶切2 h。

普通PCR 產(chǎn)物于加有Gold View的1.2%瓊脂糖凝膠、110 V 電壓下電泳20～30 min 檢測，在伯樂凝膠成像分析系統(tǒng)上顯示結(jié)果。

以上PCR SuperMix（+dye）混合液、easyTaq酶、Buffer和dNTP訂購自北京全式金生物技術(shù)公司，快切酶FastDigest MvaI 和限制性內(nèi)切酶MvaI （BstNI）酶訂購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶切前擴(kuò)增的特異標(biāo)記片段

分子標(biāo)記SCAR引物T0302和CAPS引物TG328，分別與Ty-2基因和Ph-3基因緊密連鎖，在PCR 體系中同時(shí)加入這2對(duì)引物擴(kuò)增后，酶切前產(chǎn)物條帶清晰，目的條帶符合預(yù)期，所有材料均可擴(kuò)增出500 bp的條帶（Ph-3基因酶切前抗感雜3種基因型的條帶都是500 bp），另外基因型為ty-2/ty-2 的B：CK2和材料1～3號(hào)擴(kuò)增出一條800 bp 的特異性片段，基因型為Ty-2/Ty-2的A：CK1和材料4～6號(hào)擴(kuò)增出900 bp 的SCAR標(biāo)記的特異性片段，而基因型Ty-2/ty-2 的材料7～9號(hào)還擴(kuò)增出900、800 bp這2條特異性片段，可見同時(shí)加入這2對(duì)引物酶切前對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶沒有影響、互不干擾 （圖1）。

48卷3期 林 濤等 番茄抗性基因Ty-2和Ph-3多重PCR的檢測應(yīng)用

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后的特異標(biāo)記片段

為提高效率，同時(shí)加入2對(duì)引物擴(kuò)增，20 μL產(chǎn)物加入快切酶，進(jìn)行25 μL體系的酶切反應(yīng)，凝膠電泳檢測顯示結(jié)果，以構(gòu)建Ty-2和Ph-3這2個(gè)基因標(biāo)記的多重PCR 體系。結(jié)合表1和圖2：2對(duì)引物的PCR 條帶清晰，材料1與B（CK2）基因型相同，雙感對(duì)應(yīng)顯示2條特異性條帶800、500 bp;基因型為ty-2/ty-2、Ph-3/ph-3的材料2，有800、500 和260 bp 大小的3 條特異性條帶;材料3的基因型為ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3，只有2條特異性條帶800、260 bp。純合抗病基因型為Ty-2/Ty-2的A：CK1和材料4～6號(hào)的900 bp特異性片段酶切成約550、350 bp的2條帶，4號(hào)材料（Ty-2/Ty-2、ph-3/ph-3）顯示有3條帶，5號(hào)材料含雜合Ph-3基因酶切成500、260 bp，共有4條帶，6號(hào)和A（CK1）的基因型為雙抗（Ty-2/Ty-2、Ph-3/Ph-3），有550、350 和260 bp 大小的3 條特異性條帶。材料7～9號(hào)，含雜合Ty-2基因?qū)?yīng)有900、800、550和350 bp大小的4條帶，加上Ph-3基因?qū)?yīng)顯示的條帶，雙雜材料8號(hào)最多有6條帶。

經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，快切酶將純合Ty-2基因型的特異性片段900 bp切成約550、350 bp的2條帶，而雜合Ty-2基因型則表現(xiàn)為900、800、550和350 bp共4條帶，感番茄Ty2的800 bp 大小的特異性條帶無酶切位點(diǎn);Ph-3 基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切結(jié)果不受干擾。該多重PCR同時(shí)檢測2個(gè)基因Ty-2和Ph-3時(shí)，可以通過分子標(biāo)記電泳檢測顯示找到各自的帶型，這9份材料跑出對(duì)應(yīng)基因型的9種帶型，最多顯示有6條帶的是雙雜材料8號(hào)的帶型。

2.3 同時(shí)檢測Ty-2和 Ph-3 基因多重PCR體系的優(yōu)化

研究過程中對(duì)Taq酶含量、2對(duì)引物濃度、退火溫度、PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，以及快切酶用量和酶切時(shí)間等因素進(jìn)行多重PCR技術(shù)的優(yōu)化。最終確定使用前述試驗(yàn)方法中的2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）混合液擴(kuò)增時(shí)，不再增加Taq 酶用量，CAPS標(biāo)記TG328引物正反引物濃度降為各0.2 μL （10 mmol/L），調(diào)整多重PCR退火溫度為56 ℃、快切酶酶切反應(yīng)為10 min，其他條件不變的情況下，可獲得清晰可辨的條帶。

2.4 多重PCR體系的驗(yàn)證與應(yīng)用

用該多重PCR 技術(shù)，對(duì)24 份番茄材料進(jìn)行2個(gè)基因Ty-2和Ph-3的基因型鑒定（圖3，編號(hào)1～24表示材料801～824）。材料1、5、8和14帶型相同，有550、350 和260 bp 大小的3 條帶，其基因型為雙抗。材料2、4、13和20均有800、260 bp大小的2條帶，表明它們的基因型為ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3;材料3顯示的4條帶，可知其基因型為Ty-2/Ty-2、Ph-3/ph-3;材料6、7、9～12這6份材料僅有800、500 bp大小的2條帶，說明它們的基因型為雙感;編號(hào)15～19和21～23共8份材料，顯示了相同的5條帶，表明其基因型為Ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3;材料24的帶型表明它的基因型是ty-2/ty-2、Ph-3/ph-3。

結(jié)合表2，單引物普通PCR鑒定可得材料1、3、5、8和14這5份材料含純合Ty-2 基因;7、15～19和21～23這9份材料有2條帶，說明其含雜合Ty-2基因;800 bp的單條帶表明剩余的10份材料基因型是ty-2/ty-2（圖4）。番茄晚疫病Ph3基因CAPS標(biāo)記結(jié)果如圖5，含有Ph3純合抗病基因型的材料含有酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物酶切后會(huì)產(chǎn)生260 bp的特異條帶，雜合基因型材料酶切后有500 bp和260 bp的2條特異條帶，而純合感病基因型材料酶切后只有1條長度為500 bp的條帶。材料6、7和9～12這6份材料顯示只有500 bp的單條帶，含純合感病基因;2份材料有2條帶，說明材料3和24含雜合Ph-3基因;其他16份材料均含有純合抗病基因。

上述多重PCR技術(shù)檢測的材料基因型與單引物普通PCR分別檢測所獲的基因型進(jìn)行綜合比對(duì)，兩者最終結(jié)果一致，說明選用SCAR標(biāo)記T0302引物和CAPS標(biāo)記TG328引物，同時(shí)檢測Ty-2、Ph-3基因的多重PCR 體系可行性得到進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)合圖2和圖3，實(shí)際運(yùn)用讀圖時(shí)，帶型顯示為6條帶的雙雜材料和顯示800 bp和500 bp這2條帶的雙感材料首先淘汰，材料雙抗基因型組合的帶型（顯示為3 條帶550、350和260 bp ）優(yōu)先入選，再根據(jù)這2個(gè)基因的優(yōu)先順序進(jìn)行讀圖及材料選留，如以檢測Ty-2基因優(yōu)先時(shí)先找無800 bp條帶的帶型，以檢測Ph-3基因優(yōu)先時(shí)先找無500 bp條帶的帶型，這樣很容易通過讀圖判斷篩選到目標(biāo)基因型的材料。

3 結(jié)論與討論

為快速準(zhǔn)確地鑒定篩選到番茄抗性目標(biāo)基因，要求檢測技術(shù)必須具有可靠性和操作的便利性。該研究在多重PCR 體系優(yōu)化研究過程中，對(duì)Taq酶含量、2對(duì)引物的正反引物濃度、退火溫度、PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，及酶切反應(yīng)中酶用量和反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行摸索。最終確定多重PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye） 10 μL，SCAR標(biāo)記正反引物各0.4 μL （10 mmol/L），CAPS標(biāo)記正反引物各0.2 μL （10 mmol/L），DNA 模板1 μL （100 ng），ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR 擴(kuò)增程序中退火溫度為56 ℃，時(shí)間1 min，酶切時(shí)間調(diào)整為10 min，其他條件不變。

同時(shí)使用2個(gè)共顯性分子標(biāo)記的2對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)，酶切前對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物沒有影響，產(chǎn)物經(jīng)酶切后，可清晰分辨出最多有6條帶，而且每個(gè)帶型條帶間距適當(dāng)、容易區(qū)分不同的帶型。通過帶型可知該多重PCR體系酶切反應(yīng)，對(duì)Ph-3基因的擴(kuò)增產(chǎn)物酶切結(jié)果不變，與該基因單引物普通PCR技術(shù)鑒定所得的條帶大小相同;而Ty-2純合抗病基因型900 bp的條帶酶切成550和350 bp的2條帶、雜合基因型酶切后有900、800、550和350 bp的4條帶，但對(duì)基因型Ty-2/ty-2和ty-2/ty-2的800 bp的條帶沒有影響，因此仍可通過帶型判斷它們的基因型。

此多重PCR檢測顯示結(jié)果表明，共有9種帶型對(duì)應(yīng)相應(yīng)的基因型，與單引物普通PCR分別鑒定的基因型綜合分析后的結(jié)果一致。分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展很快，李宗俊等[18]采用委托專業(yè)機(jī)構(gòu)檢測的方式，使用第三代分子標(biāo)記技術(shù)，利用KASP標(biāo)記基于已知SNP 檢測來輔助番茄育種。然而短期內(nèi)多數(shù)育種者在學(xué)習(xí)利用新技術(shù)的同時(shí)，充分應(yīng)用已有設(shè)備和相應(yīng)技術(shù)還是必經(jīng)階段。該多重PCR體系的基礎(chǔ)是第二代分子標(biāo)記技術(shù)，在實(shí)踐中，即使帶型中部分條帶顯色較弱，只要掌握一定的認(rèn)讀技巧，也可以通過帶型的條帶組成判斷基因型，它能同時(shí)檢測番茄抗黃化曲葉病毒病基因Ty-2和抗晚疫病基因Ph-3，且能區(qū)分其9種基因型組合，分子標(biāo)記操作簡便實(shí)用和省時(shí)高效。

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