(陜西津?qū)嵥痉ㄨb定中心， 西安 710075；2.山西警察學(xué)院，太原 030401；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，呼和浩特 010110)

1 前言

咖啡因(Caffeine)是從茶葉、咖啡果中提煉出來(lái)的一種生物堿，純咖啡因最初于1819年從咖啡植物中分離得到[1]。當(dāng)咖啡因在人血液中濃度超過(guò)80μg/mL時(shí)就會(huì)導(dǎo)致死亡[2、3]。因此，在法醫(yī)工作中準(zhǔn)確快速測(cè)定咖啡因在人體液中的濃度就成為十分重要的工作。測(cè)定血液和尿液中咖啡因濃度的常規(guī)方法有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[4]，高效液相色譜法(HPLC)[5、6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[7]等，但以上方法中均存在前期處理復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

QuEChERS(SPE)法具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠和安全等特點(diǎn)，因此在農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)中應(yīng)用非常廣泛[8]，但在臨床毒物和法庭毒物學(xué)領(lǐng)域生物檢材中應(yīng)用較少。在測(cè)定咖啡因中毒者血液與尿液中的咖啡因濃度時(shí)，采用QuEChERS-LC-MS/MS法可以快速、準(zhǔn)確地得到測(cè)定結(jié)果。本研究通過(guò)對(duì)1例服用咖啡因中毒死亡的典型案例，利用QuEChERS前處理結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定咖啡因中毒者血液和尿液中的咖啡因濃度的方法。

2015年初，作者對(duì)1例被發(fā)現(xiàn)死在家中的60歲女性尸體進(jìn)行了尸檢。據(jù)警方介紹，死者有5年以上的肝硬化病史，經(jīng)勘察發(fā)現(xiàn)案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)有感冒藥以及裝咖啡因片劑空瓶，推斷死亡時(shí)間在1d以內(nèi)。尸體在2～4℃冷藏柜中保存1d以后，送檢。

右手和左膝蓋部有輕微的皮下出血。眼瞼結(jié)膜、口唇粘膜、頭皮下、心臟表面有多數(shù)出血點(diǎn)。左心室內(nèi)膜有出血，心臟肥大，肺部淤血水腫，肝硬變。心臟重量為422g；胸腔內(nèi)積液右側(cè)為33mL，左側(cè)為7mL；肺重量，右肺為601g，左肺為517g。

采用氣相色譜用氫火焰離子檢測(cè)器(GC-FID)檢測(cè)死者血液中乙醇結(jié)果顯示陰性。采用免疫濫用藥物檢測(cè)板(Triage Drugs of Abuse Panel Plus TCA)對(duì)尿液進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示陰性(該檢測(cè)板不具有咖啡因檢測(cè)屬性)。采用GC-MS(血液中常見藥毒物NAGINATA篩選法[9])分析股靜脈血，除檢出咖啡因外未檢出其他常見藥毒物，遂建立死者血液和尿液中咖啡因快速測(cè)定方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1200系列快速分離液相色譜儀(美國(guó) Agilent公司)；6460 三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó) Agilent 公司)，配有電噴霧離子源(ESI)。

標(biāo)準(zhǔn)品咖啡因(Product Number:C0750;CAS Number:58-8-2;Purity(HPLC):≥99%;Water(by Karl Fischer):≤0.5%)、內(nèi)標(biāo)物己可堿(Pentifylline)(CAS No: 1028-33-7;Concentration:100%)與乙腈(色譜級(jí))購(gòu)于和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。QuEChERS分散固相萃取柱(2mL，內(nèi)含25mg PSA、25mg C18EC、150mg MgSO4)和Captiva ND Lipids凈化管(3mL)購(gòu)于安捷倫公司。

2.2 材料

檢材：死者股靜脈全血、尿液各采集10mL，-80℃超低溫冰箱保存。

2.3 色譜條件

實(shí)驗(yàn)采用Agilent1200系列快速分離液相色譜系統(tǒng)和Agilent6460三重串聯(lián)四極桿儀。色譜柱：TSKgel Amide-80(2.0mm×25cm，粒徑3μm)；流動(dòng)相A:0.1% TFA 超純水溶液:乙腈=5∶95(v∶v)溶液；流動(dòng)相B:超純水溶液:乙腈=50∶50(v∶v)溶液；梯度洗脫：0～10min，0%B～60%B，平衡時(shí)間10 min，流速為0.25mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：3.5μL；

2.4質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；噴霧電壓:500V，離子傳輸管溫度: 320℃。定性和定量均采用選擇性離子監(jiān)測(cè)(SRM)模式；咖啡因：m/z195→138、m/z195→110；己可堿：m/z265→138；碎裂電壓和碰撞能量；咖啡因：120和21V，己可堿：120和13V。

2.5 檢材前處理

采用1.5mL塑料離心管，加入0.1mL血液或尿液，加入內(nèi)標(biāo)液(己可堿的乙腈溶液1mg/mL)10μL，再加入0.9mL乙腈溶液，渦旋10 s，離心 2min(20000r/min)，移取上清液至QuEChERS分散固相萃取(SPE)柱渦旋1min，離心 2min(20000 r/min)，移取上清液用Captiva NDLipids凈化管過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)加入法

標(biāo)準(zhǔn)加入法是指將已知量的標(biāo)準(zhǔn)試樣加入到待測(cè)試樣中，測(cè)得試樣量和標(biāo)準(zhǔn)試樣的總響應(yīng)值后，對(duì)試樣進(jìn)行定量分析的方法，相比標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以消除或減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。標(biāo)準(zhǔn)加入法經(jīng)常用于原子吸收光譜分析[10]以及人體體液檢材和固體組織檢材中毒(藥)物定量分析研究中[11]。

實(shí)驗(yàn)具體步驟：配制咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、10μg/mL。取死者股靜脈全血和尿液各0.1mL7份置于1.5 mL離心管中，分別加入上述7個(gè)不同濃度的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液和10μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液各10μL，按照“2.5”項(xiàng)前處理后進(jìn)樣3.5μL，得7個(gè)點(diǎn)系列濃度。記錄咖啡因和內(nèi)標(biāo)峰面積，以Y為樣品中咖啡因和內(nèi)標(biāo)豐面積比值對(duì)添加的濃度X進(jìn)行線性回歸，得到線性方程(Y等于0時(shí)X為樣品中咖啡因濃度的負(fù)值)。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

本研究參考心臟肌肉和脂肪組織為基質(zhì)考察了基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率[12]中采用的方法應(yīng)用到股靜脈血液、尿液的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率。具體方法為:取0.1mL死者股靜脈全血和尿液樣品按“2.5”項(xiàng)前處理后用標(biāo)準(zhǔn)加入法[11]進(jìn)行分析，得到股靜脈全血和尿液中的咖啡因濃度。準(zhǔn)備咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液兩種，其濃度分別為1/10樣品濃度和10倍的樣品濃度，然后取0.1mL股靜脈全血和尿液樣本按“2.5”項(xiàng)前處理后得到萃取液，取上述兩種萃取液各0.5mL加入5μL對(duì)應(yīng)的 10倍樣品濃度的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液，渦旋，然后HPLC -MS/MS進(jìn)樣3.5μL分析得到的峰面積為“A”，不加入標(biāo)準(zhǔn)液得到的萃取液進(jìn)行HPLC-MS/MS進(jìn)樣3.5μL分析得到的峰面積為“B”，對(duì)應(yīng)的1/10樣品濃度的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液 HPLC-MS/MS進(jìn)樣3.5μL分析得到的峰面積為“C”，基質(zhì)效應(yīng)(%)等于[(A-B)/C]×100，提取回收率(%)等于[B/(A-B)]×100。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 LC-MS/MS定性分析

圖1所示為標(biāo)準(zhǔn)品咖啡因乙腈溶液、死者股靜脈全血以及尿液萃取液的質(zhì)譜圖，結(jié)果顯示兩種萃取液的質(zhì)譜圖和標(biāo)準(zhǔn)物一致，無(wú)雜峰，確認(rèn)物質(zhì)為咖啡因。

圖1 標(biāo)本提取物的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)咖啡因質(zhì)譜圖

圖2所示為咖啡因乙腈溶液、死者股靜脈全血和尿液萃取液、股靜脈萃取液添加和無(wú)添加內(nèi)標(biāo)己可堿的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖。結(jié)果表明咖啡因的保留時(shí)間為2.56min，內(nèi)標(biāo)己可堿的保留時(shí)間為1.88min，無(wú)添加內(nèi)標(biāo)的股靜脈全血在相應(yīng)時(shí)間無(wú)干擾峰。

圖2 LC-MS/MS選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

3.2 線性關(guān)系、檢測(cè)限

對(duì)案例血液和尿液中加入濃度為10～1000μg/mL 范圍的咖啡因時(shí)線性關(guān)系大于0.999，線性關(guān)系良好，如表 1所示。

表1 股靜脈全血和尿液中咖啡因標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定工作曲線

如果y=0，先前存在的濃度(x)可以以負(fù)值計(jì)算

空白血液和尿液中咖啡因在信噪比S/N=3的條件下檢出限(LOD)為10ng/mL，在信噪比S/N=10的條件下定量限(LOQ)為50ng/mL。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)、加標(biāo)回收、精密度測(cè)定結(jié)果

由于正常人體血液和尿液中本身就含有咖啡因，因此無(wú)法做空白添加實(shí)驗(yàn)，本次實(shí)驗(yàn)使用標(biāo)準(zhǔn)添加法對(duì)死者血液、尿樣中咖啡因進(jìn)行了定性和定量分析。取死者股靜脈全血和尿液各0.1mL置于1.5mL離心管中，按“2.7”項(xiàng)下方法計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率。結(jié)果顯示，基質(zhì)效應(yīng)：股靜脈血液46.9%；尿液48.2%；提取回收率：股靜脈血液87.3%；尿液65.1%(n=5)。分別于當(dāng)日和連續(xù)5日每天測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度均小于15%。結(jié)果見表 2。

表2 股靜脈全血和尿液中咖啡因精密度測(cè)定結(jié)果

以平均標(biāo)準(zhǔn)偏差給出數(shù)據(jù)；RSD：相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3.4 定量結(jié)果

對(duì)死者的股靜脈全血和尿液進(jìn)行了按“2.5”項(xiàng)前處理后用標(biāo)準(zhǔn)加入法[11]進(jìn)行分析，結(jié)果顯示股靜脈全血樣品中咖啡因濃度為137μg/mL，尿液中咖啡因濃度為80.3μg/mL。

4 討論

已報(bào)道的全血和尿液中的咖啡因濃度分析方法， HPLC法[5、6]雖然成本低，但存在分析時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低等缺點(diǎn)，不適合于全血和尿液中的咖啡因的快速測(cè)定。GC-MS[13、14]法存在預(yù)處理復(fù)雜，樣品需要?dú)饣?，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)的不足，也不適合咖啡因中毒案例當(dāng)中的快速測(cè)定。文獻(xiàn)[7]采用LC-MS/MS測(cè)定顯示咖啡因的出峰時(shí)間超過(guò)5min，而且預(yù)處理簡(jiǎn)單沒有凈化管凈化，容易污染色譜柱。本實(shí)驗(yàn)采用的QuEChERS 預(yù)處理法結(jié)合HPLC-MS/MS法分析血液和尿液中的咖啡因，全程分析在10min內(nèi)完成，具有靈敏度高、樣品處理簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)。本研究另一優(yōu)勢(shì)在于試驗(yàn)中使用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)被測(cè)的血液、尿液試樣中直接加入標(biāo)準(zhǔn)咖啡因液以及內(nèi)標(biāo)液進(jìn)行定量分析，無(wú)需空白樣品添加實(shí)驗(yàn)，從而消除基質(zhì)效應(yīng)、保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本方法分析經(jīng)勻漿處理的固體組織檢材，如腦、心臟、肝臟以及肌肉等組織中咖啡因，同樣取得了較高的提取回收率，證明該方法也適用于無(wú)體液材料的咖啡因中毒案例中咖啡因的定量分析。隨著QuEChERS 預(yù)處理技術(shù)發(fā)展，在臨床毒物和法庭毒物學(xué)領(lǐng)域生物檢材中有廣泛的應(yīng)用空間。