(1.國家納米科學(xué)中心，北京100190；2.島津企業(yè)管理(中國)有限公司，北京 100020)

阿霉素屬于蒽環(huán)類細(xì)胞毒性抗生素，抗癌譜廣且治療指數(shù)高，目前廣泛用于白血病及乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等實(shí)體腫瘤的治療，是臨床常用的惡性腫瘤化療藥物之一，結(jié)構(gòu)見圖1。但是，由于阿霉素在體內(nèi)的代謝效果不佳，因而會產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)，在生物體內(nèi)會產(chǎn)生嚴(yán)重的心臟毒性和骨髓抑制作用[1-3]，需要體內(nèi)藥物濃度測定及病理分析等數(shù)據(jù)進(jìn)行客觀評價(jià)。近年來，人們在研究阿霉素血漿藥物濃度的同時(shí)，其生物體內(nèi)藥物濃度定量分析檢測也受到重視，兩者更好的結(jié)合能闡明阿霉素在體內(nèi)代謝過程，有效地評價(jià)生物利用度[4-6]。

阿霉素在生物體內(nèi)測定方法國內(nèi)報(bào)道主要有HPLC-UV、熒光光度法、高效毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等方法[7-10]，而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法報(bào)道較少。但這些方法均存在選擇性差、靈敏度低、分析時(shí)間長等缺點(diǎn)，技術(shù)要求復(fù)雜，不利于大量樣品的測定。本實(shí)驗(yàn)采用正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式，建立了一種新的操作簡便、快速、靈敏、特異的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測定阿霉素在達(dá)腫瘤部位的藥物濃度的方法，并對其進(jìn)行專屬性、線性范圍、檢測限、準(zhǔn)確度、精密度、回收率和穩(wěn)定性的考察，旨為進(jìn)一步開發(fā)利用阿霉素在生物體內(nèi)的分布奠定基礎(chǔ)。

圖1 阿霉素(C27H29NO11)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

LC-MS/MS 8050液質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津公司)；電噴霧離子化電離源(ESI)、LabSolutions軟件(Ver.5.91)；BS224S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；HH-1型旋渦混勻器(北京賽歐華創(chuàng)科技有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)； DY89-II型玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Milli-Q ADVANTAGEA10純水儀(美國Merck Millipore 公司)。

1.2 試劑材料與實(shí)驗(yàn)動物

MCF-7乳腺癌細(xì)胞系(中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)；DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清(Life Technology公司)；阿霉素標(biāo)準(zhǔn)品(廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司)；柔紅霉素(北京沃凱生物科技有限公司)；甲醇(美國Fisher公司產(chǎn)品)；甲酸(美國Sigma公司)；固相萃取柱(日本島津公司)；其他試劑均為分析純，水為超純水。

25只雌性BALB/c-nu小鼠，體重(20±2)g，動物合格證號：SCXK(京)2016-0006由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件

Shim-Pack GISS-HP C18色譜柱(100mm×2.1mm×3μm)；流動相：A相為含0.1%甲酸的超純水，B相為甲醇；采用梯度洗脫程序：0～0.5min，10%～80%B；0.5～2.5min，80%～100%B；2.5～3min，100%B；3.1～7min，100%～80%B；柱溫40℃；流速0.2mL/min；進(jìn)樣體積1μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI源)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，正離子電離模式；離子噴霧電壓：4.5kV；霧化氣(氮?dú)?流速：3.0 L/min；加熱氣(空氣)流速10L/min; 干燥氣(氮?dú)?流速：10L/min；脫溶劑管溫度250℃；加熱模塊溫度：400℃；離子源溫度：300℃；用于定量的離子分別為阿霉素m/z544.2→397.2，柔紅霉素(內(nèi)標(biāo))m/z528→321。質(zhì)量掃描范圍m/z100～1000。樣品測試前，使用調(diào)諧液校正質(zhì)量軸。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取1.00mg阿霉素標(biāo)準(zhǔn)品，置于1mL容量瓶中，用超純水溶解稀釋并定容，配制成濃度為1.00 g/L的母液；然后用50%甲醇水再逐級稀釋成濃度分別為100、200、400、1000、5000、10000μg/L的工作液，置于4℃冰箱。

精密稱取1.00mg柔紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品，置于1mL容量瓶中，用超純水溶解稀釋并定容，配制成濃度為1.00g/L的母液；取上述儲備液用50%甲醇水稀釋成濃度為15μg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，置于4℃冰箱。

1.4.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：

DMEM高糖培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清，細(xì)胞接種于100 mm2培養(yǎng)皿中，置于5% CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合度80%左右時(shí)傳代備用。

1.4.3動物實(shí)驗(yàn)

選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)80～90%左右密度為宜，用胰酶消化細(xì)胞后用PBS清洗兩次，再用PBS吹打細(xì)胞沉淀至合適的濃度，細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。皮下瘤接種細(xì)胞量為1～5×106個(gè)細(xì)胞/只，接種體積為100μL，因此細(xì)胞懸液的濃度為1～5×107個(gè)細(xì)胞/mL，細(xì)胞與Matrigel基質(zhì)膠1∶1混勻后，用胰島素注射器注入小鼠皮下。BALB/c-nu小鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下(濕度(50±10)%，溫度25±2℃，12h晝夜循環(huán))進(jìn)食進(jìn)水，實(shí)驗(yàn)前禁食12h。BALB/c-nu小鼠荷瘤后，待腫瘤體積長到約150mm3，按照0.2mg/kg劑量尾靜脈注射，開始給藥。

1.4.4樣品前處理

稱取2.5g勻漿后的樣品，加入80%乙腈10mL，旋渦震蕩，置于預(yù)置好的4℃高速冷凍離心機(jī)內(nèi)4000r/min高速離心5min，取上清液待凈化。加入1mL甲醇，渦旋5min，超聲溶解15min。提前用甲醇水(1∶1)對固相萃取柱進(jìn)行活化平衡，將待凈化液上樣至固相萃取柱進(jìn)行過柱，依次用水、50%甲醇溶液各1mL淋洗，抽干。用甲醇洗脫，收集洗脫液用氮?dú)獯蹈桑?mL初始流動相定容，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，上機(jī)待測。

1.4.5樣品采集與制備

將小鼠尾靜脈注射0.2mg/kg阿霉素，在2h后處死，取腫瘤組織，以蒸餾水洗凈，稱其質(zhì)量；按質(zhì)量-體積比1∶5向各組織中加入生理鹽水，冰上勻漿后，按照“1.4.4”項(xiàng)對樣品進(jìn)行前處理后轉(zhuǎn)移至1.5mL Eppendorf管內(nèi)，向每個(gè)樣品中加入10μL 15μg/L柔紅霉素內(nèi)標(biāo)溶液，用流動相定容至1mL；經(jīng)0.45μm濾膜過濾，置于4℃冰箱中，上機(jī)待測。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取100μL空白小鼠的組織(腫瘤)勻漿清液于1.5mL Eppendorf管中。向每個(gè)樣品中加入不同質(zhì)量的阿霉素配制成濃度分別為100、200、400、1000、5000、10000μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；加入10μL 15μg/L柔紅霉素作為內(nèi)標(biāo)，用移液槍混勻，再加入300μL甲醇，渦旋5min，以13000r/min離心10min，取上清液；經(jīng)0.45μm濾膜過濾，進(jìn)樣檢測。測得的阿霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)柔紅霉素峰面積的比值Y對藥物濃度X進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 專屬性考察

在電噴霧正離子模式下，總離子流圖見圖2。通過比較供試空白組織色譜圖、向空白組織中加入待測物和內(nèi)標(biāo)物后得到的總離子流圖(TIC)、提取離子流圖(EIC)和給藥后不同時(shí)間測得的色譜圖，待測藥物阿霉素和內(nèi)標(biāo)柔紅霉素的保留時(shí)間分別為1.49min和1.62min。結(jié)果表明，空白組織中所含內(nèi)源性物質(zhì)不干擾被測物及內(nèi)標(biāo)物的測定，被測物峰形良好。

圖2 腫瘤組織MRM質(zhì)譜圖A.空白組織；B.空白組織加入阿霉素及內(nèi)標(biāo)柔紅霉素；C.小鼠尾靜脈注射阿霉素2h后腫瘤組織樣品；1.阿霉素；2.內(nèi)標(biāo)柔紅霉素

2.3 線性范圍及檢測限

按照“2.1”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣1μL，記錄色譜圖；以待測藥物濃度X(μg/L)為橫坐標(biāo)，待測藥物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比Y為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(w=1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得的直線回歸方程為：Y=0.00454786X-0.270637(r=0.9999580)。結(jié)果表明，阿霉素在腫瘤組織內(nèi)藥物濃度在100～10000μg/L內(nèi)，質(zhì)譜響應(yīng)的線性關(guān)系良好，以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算檢出限(LOD)，得阿霉素的LOD為0.56μg/L。

2.4 日內(nèi)與日間精密度與方法回收率

取空白小鼠腫瘤組織提取液100μL，按 “1.4.1”項(xiàng)下分別配制阿霉素勻漿液高、中、低3個(gè)濃度(100、400、10000μg/L)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行5個(gè)樣本分析，連續(xù)測定3d，為保持實(shí)驗(yàn)條件一致，標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定與上述樣品測定同時(shí)進(jìn)行。以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度，將QC樣品的結(jié)果進(jìn)行計(jì)算并分析，精密度和回收率結(jié)果見表1。結(jié)果表明：阿霉素在腫瘤組織提取液中的日內(nèi)和日間精密度RSD均小于15%，方法回收率良好[11]，均可滿足2015版藥典四部通則中對于生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中相關(guān)規(guī)定。

表1 測定方法的精密度、準(zhǔn)確度和回收率

2.5 穩(wěn)定性考察

按“1.4.1”項(xiàng)下分別配制阿霉素腫瘤組織提取液高、中、低3個(gè)濃度的QC樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行3個(gè)樣本分析。分別將樣品在室溫(約20℃)下放置6h、4℃下冷藏8h、-20℃凍融循環(huán)3次，按“1.4.4”、“1.4.5”項(xiàng)下操作處理后進(jìn)樣測定，考察小鼠的腫瘤組織提取液中阿霉素在室溫、冷藏、反復(fù)凍融條件下的穩(wěn)定性。以每一濃度3個(gè)樣本分析，3種情況下穩(wěn)定性樣品與新配制樣品的峰面積比值均在80%～120%之間，說明阿霉素在本研究考察的儲存條件下較穩(wěn)定[11]。

表2 阿霉素在腫瘤組織基質(zhì)中的穩(wěn)定性(X±SD，n=3)

注：表中數(shù)據(jù)=(穩(wěn)定性樣品峰面積/理論樣品峰面積)×100%

3 結(jié)論

本研究建立了LC-MS/MS在小鼠腫瘤組織測定阿霉素藥物濃度的方法，該方法簡便快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、分析效率好，可彌補(bǔ)阿霉素類物質(zhì)在紫外吸收差、檢測限值高的缺陷。另外樣品前處理是藥物分析的關(guān)鍵部分，由于生物樣品的介質(zhì)組成比較復(fù)雜，如前處理不好，嚴(yán)重影響檢測結(jié)果，而本方法中采用先甲醇直接沉淀蛋白的方法對生物樣品進(jìn)行預(yù)處理，同時(shí)結(jié)合固相萃取柱的方式，重現(xiàn)性好，回收率高，操作簡便，選擇沉淀蛋白的溶劑與所選用的流動相一致，不會有其他成分干擾，成本較低，為檢測創(chuàng)造了良好的條件。液相色譜儀結(jié)合色譜柱的使用，提高了色譜的分離效率，加快了分析速度。質(zhì)譜檢測采用電噴霧正離子電離模式，在尾靜脈注射阿霉素小鼠的腫瘤部位能檢出阿霉素，阿霉素定量范圍在100～10000μg/L之間。該方法適用于生物樣品中阿霉素類成分的高通量分析。