(杭州綠潔環(huán)境科技股份有限公司，杭州 310015)

微囊藻毒素(microcystins，MC) 是一類具有生物活性的環(huán)狀七肽毒素物質(zhì)，可由銅綠微囊藻、魚腥藻、束絲藻、念珠藻等產(chǎn)生，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有90多種MC異構(gòu)體[1]。由于其對肝臟、腎臟等器官毒性以及強促癌性，微囊藻毒素已被認為是嚴重威脅野生動植物以及人類健康的環(huán)境污染物，并得到廣泛關(guān)注[2]。國家標準GB/T5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》中規(guī)定的MC-LR最大殘留限量為1.0 μg /L[3]。

目前檢測MC的研究方法主要有生物毒理檢測法、化學(xué)分析法、以及生物化學(xué)分析方法等[4]。生物毒理檢測法主要包括動物毒性法和細胞毒性法[5]；化學(xué)分析法有高效液相色譜(HPLC)法[6]、氣相色譜(GC)法[7]、薄層層析色譜(TLC)法[8]、毛細管電泳(CE)法[9]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法[10]等；生物化學(xué)分析法包括酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法[11]和蛋白磷酸酶抑制(PPIA)法[12-15]；分子生物學(xué)法即PCR檢測法[16]。其中HPLC-MC聯(lián)用是定量檢測和分析MC的經(jīng)典可靠技術(shù)，檢測限在ng級，但MC標樣的缺乏使該法的應(yīng)用受到限制，而且其所需設(shè)備昂貴，檢測成本高，對操作人員的專業(yè)技術(shù)要求高。以生物學(xué)為基礎(chǔ)的PPIA、PCR等技術(shù)檢測精度高，但要大規(guī)模的應(yīng)用尚需在穩(wěn)定性的保持、操作的簡便和經(jīng)濟性等方面加強和提高。ELISA 商品試劑盒對樣品前處理要求低、操作簡單、檢測靈敏度和選擇性高，但是交叉反應(yīng)變化比較大，且能檢測的MC 的種類較少。因此使水環(huán)境中MC 的分析和檢測更加經(jīng)濟、方便、快速和準確，并實現(xiàn)水中MC的連續(xù)和自動檢測分析是研究的重點。

為開發(fā)一種利用生物法檢測水中微囊藻毒素的自動檢測儀，經(jīng)過調(diào)研發(fā)現(xiàn)磷酸酶法具有檢測過程簡單，檢測成本低，靈敏度高等優(yōu)點。因此選用磷酸酶法作為自動檢測儀分析方法，對樣品中的微囊藻毒素含量進行分析。首先在實驗室酶標儀上驗證該方法的可行性。根據(jù)實驗室驗證結(jié)果及檢測流程設(shè)計芯片及各個模塊，并測試芯片及模塊功能。最后進行儀器整機安裝調(diào)試、運行測試及實際站點試用。

采用多通道微流芯片微管路定量、微量注射泵定量避免各種試劑的交叉污染。三維運動機械臂進行各位點定位及試劑加樣。設(shè)置清洗模塊對各試劑管路及進樣針進行清洗，恒溫模塊提供酶反應(yīng)所需要的溫度條件，設(shè)置光電檢測模塊對酶底物顯色反應(yīng)產(chǎn)物進行405nm處吸光度檢測，通過吸光度大小對微囊藻毒素含量進行定量。將各模塊進行組合，并用安卓系統(tǒng)進行控制，得到一種高效、快速、自動檢測水中微囊藻毒素的檢測儀，儀器開發(fā)流程圖如圖1所示。

圖1 儀器開發(fā)流程圖

1 檢測原理

基于微囊藻毒素對磷酸酶活性具有強烈的抑制效應(yīng)的特點，通過對磷酸酶活性的測定得到微囊藻毒素對磷酸酶活性的抑制程度，抑制程度大小與微囊藻毒素濃度呈正相關(guān)性，進而對樣品中的微囊藻毒素含量進行分析。

2 檢測流程

儀器檢測流程如圖2所示，測試開始后首先于反應(yīng)模塊中加入水樣、磷酸酶溶液、顯色底物。37℃條件下，三者混合后水樣中的微囊藻毒素會導(dǎo)致部分磷酸酶失活，而仍具有生物活性的磷酸酶會作用于顯色底物發(fā)生顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)結(jié)束后，加入酸終止顯色反應(yīng)，并在405nm處檢測顯色產(chǎn)物吸光度，微囊藻毒素含量與顯色產(chǎn)物吸光度大小成反比。檢測完成后純凈水清洗管路、進樣針管、反應(yīng)模塊、檢測模塊等。

圖2 微囊藻毒素自動檢測儀檢測流程

3 儀器設(shè)計

根據(jù)以上檢測流程需求設(shè)計微囊藻毒素自動檢測儀的各功能模塊，儀器整體設(shè)計圖如圖3所示，主要部件包括進樣系統(tǒng)(主要包括定量芯片、機械臂、微量注射泵等部件)、清洗站、反應(yīng)(溫控)模塊、檢測(比色)模塊、控制系統(tǒng)5大模塊。

圖3 微囊藻毒素自動檢測儀設(shè)計圖

3.1 進樣系統(tǒng)

進樣系統(tǒng)是一個由定量芯片、機械臂、微量注射泵、蠕動泵、試劑存放區(qū)、氣泵和進樣管道組成的完整的采樣系統(tǒng)，試劑管路由防腐蝕的材料構(gòu)成，不會因試劑或?qū)嶋H水樣的腐蝕而影響測定結(jié)果。利用三維運動機械臂進行各個位點精確定位及試劑加樣，保證試劑被添加到反應(yīng)模塊。

3.1.1定量芯片

采用微流芯片中微米級管道進行單獨定量添加各種測試劑，定量準確且避免交叉污染。

(1)芯片設(shè)計

微流芯片包括3條定量通道，分別為70μL流磷酸酶試劑通道、90μL顯色底物通道、70μL終止液通道。通道上部設(shè)有試劑溢流口及氣泵進氣口，下部設(shè)有試劑進口、試劑出口，利用三通閥控制進口、出口開關(guān)。利用蠕動泵將試劑泵入芯片，通過控制蠕動泵轉(zhuǎn)速及轉(zhuǎn)動時間保證試劑充滿芯片通道，多余試劑溢流回試劑瓶。利用氣泵將芯片通道中試劑吹入各反應(yīng)模塊。通過節(jié)流閥門調(diào)節(jié)控制氣流大小，三通閥控制氣泵進氣口的開關(guān)，通過控制氣泵工作時間保證將試劑全部排出芯片通道，芯片三維效果圖如下圖4所示

圖4 微流定量芯片三維圖

(2)芯片制作

芯片制作包括芯片基片的加工制作、基片與蓋片之間的鍵合。芯片采用PMMA材料。根據(jù)設(shè)計圖紙進行備料，上機臺CNC編程進行芯片基片的加工。加工結(jié)束后需去除通道表面及基片表面的毛刺，先用2000號砂紙進行粗拋光，然后用布輪將拋光液進行精拋光，保證芯片表面的平行度及芯片內(nèi)部通道的光滑度，防止通道堵塞情況出現(xiàn)。

采用熱壓鍵合方法對芯片基片及蓋片進行鍵合。首先檢測鍵合設(shè)備狀態(tài)是否正常，在兩加熱板之間放入預(yù)鍵合的基片及蓋片，兩者對齊并放置好，芯片上下面放置拋光的鋼化玻璃，防止芯片因熱變形導(dǎo)致表面不平，放置好后關(guān)閉艙門。抽真空至真空度到-0.1MPa 后開始對芯片進行加壓操作。調(diào)節(jié)調(diào)壓閥鈕，待芯片鍵合艙內(nèi)的壓力指數(shù)達到2.0MPa后停止加壓力。調(diào)節(jié)調(diào)溫旋鈕到所需的鍵合溫度，對芯片加熱直至95℃，鍵合時間為180s。鍵合完畢后取出芯片進行測試，檢測通道是否有堵塞、漏氣、通道體積定量不準等問題。

3.1.2微量注射泵

由于實際水樣中可能含有顆粒物質(zhì)，聚集或者沉淀容易堵塞微流管道及其進出口。所以選用最大體積為1mL微量注射泵進行實際廢水樣品進樣，防止管道堵塞情況發(fā)生。由步進電機控制注射泵活塞，通過步進電機步數(shù)控制注射泵抽取試劑體積，最大步數(shù)為2000步(1mL)，最小步數(shù)為1步。

3.1.3機械臂

選用越疆DOBOT機械臂，該機械臂具有X-Y-Z三維運動功能，重復(fù)定位精度為0.2 mm。TTL接口并行方式傳輸數(shù)據(jù)，由驅(qū)動板主控電路板上輸出的TTL數(shù)據(jù)信號經(jīng)電纜線直接傳送到控制系統(tǒng)面板的輸入接口，通過控制系統(tǒng)對機械臂進行控制。

所有試劑管路出口端穿過不銹鋼空心針管，將針管固定于機械臂爪子上，其中芯片定量試劑針管出口端高度高于微量注射泵定量試劑針管出口端。利用機械臂兩點定位法定位不同的點位，例如水樣位、反應(yīng)位、檢測位、清洗位等，機械臂到不同的位點進行試劑抽取或者試劑添加動作。

3.2 清洗站

儀器設(shè)置有清洗站，主要用于抽取試劑的針管、試劑管路、反應(yīng)模塊、檢測模塊的清洗，防止不同樣品、試劑之間的交叉污染。利用蠕動泵提供動力抽取純凈水至清洗站，清洗站為帶有底座的雙層空心圓柱體，純凈水從底部進入內(nèi)層腔體，廢液及溢流液體從外層環(huán)形腔體體排出至廢液瓶。

3.3 反應(yīng)模塊

反應(yīng)部分是指恒溫水浴酶反應(yīng)顯色模塊。內(nèi)置加熱棒進行加熱，PT100溫度傳感器進行溫度檢測。反應(yīng)腔內(nèi)加水加熱至37℃，后插入試管，反應(yīng)模塊實物圖如下圖5所示。顯色反應(yīng)在試管內(nèi)進行。

圖5 反應(yīng)模塊實物圖

3.4 檢測模塊

檢測位用于顯色終止后顯色產(chǎn)物吸光度的檢測。內(nèi)置光源、微量比色皿、光電池等部件，組合成為一個405nm處吸光度檢測器。測定值輸出信號應(yīng)穩(wěn)定，每次檢測樣品前進行空白樣檢測，扣除背景干擾，以保證測量數(shù)據(jù)的準確性。

3.5 控制系統(tǒng)

3.5.1控制系統(tǒng)設(shè)計

控制部分包括系統(tǒng)控制硬件和軟件，系統(tǒng)控制硬件采用安卓Y7P10觸摸屏系統(tǒng)，具有數(shù)據(jù)采集、處理、顯示存儲和數(shù)據(jù)輸出等功能；具有故障信息反饋功能；帶有RS485和RS232接口，符合HJ/T 212標準具有模擬量和數(shù)字量輸出接口，通過數(shù)字量接口可接收遠程控制指令；符合HJ 477標準數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)應(yīng)存儲至少12個月的原始數(shù)據(jù)，可以設(shè)置條件查詢和顯示歷史數(shù)據(jù)。將檢測流程編譯為腳本語言，并將腳本文件導(dǎo)入至安卓系統(tǒng)，儀器各組件和模塊按照腳本語言指令執(zhí)行測試功能。

3.5.2電路系統(tǒng)設(shè)計

微囊藻毒素自動檢測儀電路設(shè)計主要為了實現(xiàn)儀器各模塊電子元器件(三通閥、蠕動泵等)的控制，對各功能模塊進行連接。詳細的電路設(shè)計圖分為主電路設(shè)計、單片機電路設(shè)計、通訊電路、電機控制電路、光度計模擬信號采集電路、電源電路、開關(guān)控制電路、大功率開關(guān)控制電路和溫度讀取電路等。

其中主電路主要對各個功能模塊電路以及各電路之間的連接關(guān)系設(shè)計。電路主圖設(shè)計如圖6所示。

圖6 主電路設(shè)計圖

單片機電路主要功能是對輸入的指令進行分析處理，控制相對應(yīng)的電路，實現(xiàn)顯示屏操作與電路運轉(zhuǎn)的銜接。系統(tǒng)中使用STM32單片機控制，并與各個控制模塊之間使用隔離芯片進行隔離處理。經(jīng)處理后，單片機與各個控制模塊之間可以更好的工作，將相互影響降到最低，使信號更加穩(wěn)定。

光度計模擬信號采集電路主要功能是檢測模塊中讀取光強的電路。該電路支持兩路交流信號輸入采集，一路為參比通道，一路為檢查通道，支持自動調(diào)節(jié)量程，手動進行光強的微調(diào)，并擁有高頻和低頻濾波，使信號更加穩(wěn)定。除此之外還支持一路直流信號輸入采集。

電源電路主要是對各模塊電路進行供電。電源輸入采用BNX002進行濾波處理，模擬電路和數(shù)字電路都采用隔離供電，減少因為電源互相帶來的影響。

開關(guān)電路主要對各模塊的開關(guān)進行控制，大功率開關(guān)電路主要是加熱模塊的開關(guān)電路，溫度讀取電路是對溫控模塊溫度的讀取電路。

4 試劑耗材

(1)磷酸酶法試劑采用ABRAXIS公司的微囊藻毒素檢測試劑盒Microcystins PP2A試劑盒(PN520032 96T)，該試劑盒包括以下試劑：

①零點校正液：空白溶液，用于零點校正；

②標準溶液: 微囊藻毒素標準溶液；

③磷酸酶；

④磷酸酶稀釋液；

⑤顯色底物；

⑥終止液。

(2)測試清洗模塊用水為純凈水。

(3)微囊藻毒素LR(CAS號：101043-37-2 100μg 含量95%以上 )，購自國家標準物質(zhì)網(wǎng)。

5 儀器測試分析

5.1 定量曲線建立

利用微囊藻毒素自動檢測儀分別測試不同濃度微囊藻毒素標準樣品0μg/L、0.25μg/L、0.75μg/L、1.0μg/L、2.5μg/L，得到微囊藻毒素濃度-吸光度曲線作為微囊藻毒素定量曲線。

所測得微囊藻毒素定量曲線由圖7所示，曲線方程為：y=1.957e-0.626x(R2=0.9921)。該方法檢測量程為0～2.5μg/L，與實驗室酶標儀分析結(jié)果一致。高濃度水樣需要進行稀釋操作。

圖7 微囊藻毒素定量曲線

5.2 精密度

在環(huán)境條件下，利用微囊藻毒素自動檢測儀分別重復(fù)測定80%量程標準(2.0μg/L)溶液6次，各次指示值xi，計算xi的相對標準偏差即為儀器示值的精密度。xi的相對標準偏差即精密度計算公式如下：

(1)

式中：

RSD——儀器示值的重復(fù)性誤差；

n——測量次數(shù)。

連續(xù)檢測量程上限80%標準溶液6次，計算得到精密度為9.1%，結(jié)果如表1所示。

表1 精密度測定結(jié)果

5.3 檢出限

取空白溶液作測量點，利用微囊藻毒素自動檢測儀分別對其重復(fù)測量10次，記錄儀器的測得值，按照計算公式(2)和式(3)計算儀器的檢出限D(zhuǎn)L：

DL=3s

(2)

(3)

式中：

ρi——第i次測量的測得值，μg/L；

n——測量次數(shù)(次)。

連續(xù)測試空白溶液10次，經(jīng)過計算得到檢出限為0.075μg/L，結(jié)果如表2所示。

表2 檢測限檢測結(jié)果

5.4 實際水樣對比試驗

在環(huán)境條件下，選擇3種實際水樣，分別利用微囊藻毒素自動檢測儀與國標GB/T 5750.9-2016中采用高效液相色譜法對每種水樣的濃度水平進行對比測試，每種水樣的實際比對測試次數(shù)不少于3次，計算該水樣相對誤差絕對值的平均值，對比試驗過程應(yīng)保證微囊藻毒素自動檢測儀與國標推薦方法測定水樣的一致性。

水樣相對誤差絕對值的平均值計算方法如下。

(4)

式中：

Xn——微囊藻毒素分析儀測定水樣第 n 次的測量值；

B——用實驗室國標方法測定水樣的測量值；

n——對比試驗次數(shù)。

利用儀器、實驗室標準方法比對測試水源水、管網(wǎng)水、出廠水水樣，測試結(jié)果如表3所示，實際水樣儀器測試結(jié)果與標準方法測試結(jié)果相對誤差在±10%以內(nèi)。

表3 實際水樣比對測試結(jié)果

5.5 儀器性能指標

綜合以上測試結(jié)果，微囊藻毒素自動檢測儀的性能指標如表4所示。

表4 微囊藻毒素自動檢測儀的性能指標

6 結(jié)論及展望

對儀器性能進行測試，檢測范圍為0～2.5μg/L，重復(fù)性為9.1%，檢出限為0.075μg/L，實際水樣儀器測試結(jié)果與標準方法測試結(jié)果相對誤差在±10%以內(nèi)。

水中其他物質(zhì)的存在可能對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，且缺少合適的前處理裝置，當(dāng)實際水樣中的顆粒物較多時，容易導(dǎo)致管路的堵塞，影響分析結(jié)果。后期研究將專注于水樣前處理裝置研究及高通量多個樣品同時檢測研究。