管善國 陳 霈 孫文斐

酶聯(lián)免疫吸附測定方法是以酶免疫技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展出的一種新型的免疫測定技術(shù)，依據(jù)酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物與酶的響應(yīng)底物能夠產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顯色程度與被測樣品中待測抗體(或抗原)的含量有關(guān)，根據(jù)顯色物吸光度值確定待測物質(zhì)含量，不同待測顯色物質(zhì)有其各自的特征吸收譜線，并符合郎伯-比爾定律(Lambert-Beer law)，可通過吸光度的測量實現(xiàn)含量分析。酶標(biāo)分析儀即用此原理，在臨床上可實現(xiàn)肝炎、艾滋病病毒、梅毒、腫瘤標(biāo)記物以及風(fēng)濕免疫類系列等數(shù)種病理診斷，具有靈敏度高，特異性強等特點。

由于分析過程中試劑樣品的定量加注、恒溫孵育過程較為耗時，工作量繁復(fù)，由此產(chǎn)生了集樣品試劑自動分配、孵育溫度控制以及吸光度測量為一體的全自動酶免分析儀，大幅提高了效率，隨著生產(chǎn)技術(shù)的提高，成本降低，生產(chǎn)廠家和型號不斷增加，其社會擁有量增多，在綜合醫(yī)療機構(gòu)已有取代酶標(biāo)儀的趨勢。

全自動酶免分析儀主要由儀器柜、裝載塔、樣品和試劑區(qū)、酶標(biāo)板傳送系統(tǒng)、恒溫孵育倉、洗板機、比色器、讀數(shù)器、計算機和內(nèi)部條碼掃描器組成。儀器通過加樣、溫育、洗板、加酶標(biāo)物、加顯色劑、加終止液和比色過程獲得分析結(jié)果。其中比色器實現(xiàn)吸光度的測量，是最終測量結(jié)果的引用數(shù)據(jù)；洗板機實現(xiàn)洗板、加酶標(biāo)物、加顯色劑以及加終止液功能，其洗板效果、加注試劑樣品的準(zhǔn)確性直接影響測量結(jié)果；恒溫孵育倉實現(xiàn)樣品的預(yù)溫功能，由于測量時需保留樣品盒試劑原免疫活性與酶活性，對溫度設(shè)定和控制需要保證準(zhǔn)確可靠。其他部分實現(xiàn)樣品貯存流轉(zhuǎn)和數(shù)據(jù)處理功能。

目前，尚無針對全自動酶免分析儀的檢定規(guī)程或校準(zhǔn)規(guī)范。因此，根據(jù)儀器結(jié)構(gòu)特點和工作原理，其校準(zhǔn)工作主要包括吸光度和波長的校準(zhǔn)、洗板機性能、注樣精度校準(zhǔn)和孵育溫度校準(zhǔn)三部分。由于國家計量檢定規(guī)程“酶標(biāo)分析儀”(JJG861-2007)[1]中已經(jīng)規(guī)定了酶標(biāo)儀中吸光度和波長的檢定校準(zhǔn)方法，在全自動酶免分析儀中關(guān)于吸光度和波長的校準(zhǔn)方法可以參照該規(guī)程執(zhí)行，但全自動酶免分析儀的洗板機性能和孵育溫度尚無校準(zhǔn)方法。因此，將重點討論洗板機性能和孵育溫度的校準(zhǔn)方法。

1 吸光度示值和波長校準(zhǔn)

1.1 校準(zhǔn)設(shè)備

校準(zhǔn)設(shè)備使用酶標(biāo)分析儀標(biāo)準(zhǔn)測試板、干涉濾光片和分光光度計。

1.2 校準(zhǔn)方法

儀器比色系統(tǒng)實現(xiàn)吸光度測量，主要由光源、單色器、樣品室和檢測器構(gòu)成。單色器有單波長和連續(xù)可調(diào)式，依據(jù)國家計量檢定規(guī)程“酶標(biāo)分析儀”(JJG861-2007)[1]可實現(xiàn)全自動酶免分析儀吸光度示值誤差示值穩(wěn)定性和重復(fù)性、波長示值誤差和重復(fù)性、靈敏度以及通道差異的校準(zhǔn)。進(jìn)行吸光度示值誤差、示值穩(wěn)定性和重復(fù)性測試時，將標(biāo)準(zhǔn)吸光度板放入傳送帶，送入比色室，選取單一波長、吸光度測量模式以空氣作空白，即可讀取數(shù)據(jù)并判定結(jié)果。波長校準(zhǔn)時，對連續(xù)波長方式由短波向長波逐點測出標(biāo)準(zhǔn)濾光片的波長-吸光度值，求出相應(yīng)峰值波長，計算其誤差。對單波長方式，用分光光度計測量儀器所帶波長濾光片透過率，繪制波長-透射比特性曲線，計算其峰值結(jié)果。

2 洗板機性能校準(zhǔn)

洗板機利用壓力泵正負(fù)壓將清洗液定量注入微孔板容器內(nèi)對其進(jìn)行清洗，再將微孔板容器內(nèi)的清洗液吸入廢液瓶內(nèi)，通過設(shè)定的重復(fù)清洗過程使微孔板達(dá)到清潔，其加注系統(tǒng)可實現(xiàn)加酶標(biāo)物、加顯色劑和加終止液功能。根據(jù)沖洗壓力、沖洗距離、沖洗時間、震蕩、渦流、底部沖洗、兩點吸液以及連續(xù)式?jīng)_洗等需要可選擇多種方式。

洗板機主要由以下4部分組成：①控制顯示系統(tǒng)，設(shè)定工作程序、顯示設(shè)置參數(shù)以及計時等功能；②負(fù)壓系統(tǒng)，提供清洗液和廢液回收；③加注系統(tǒng)，可自動定位、注液和吸液；④微孔板架。加注系統(tǒng)具有精密定量注液和吸液功能，注液是洗板機向微孔內(nèi)注入設(shè)定的液體體積，吸液是抽吸后的微孔內(nèi)液體，其殘留液體越少越好。微孔板由多個微量器皿連接組成，用于盛裝微量液體供分析使用。洗板機主要參數(shù)有注液量、吸液殘留量、洗板次數(shù)、浸泡時間、延遲時間、吸液時間以及自動預(yù)洗間隔時間等。其中，注液量、吸液殘留量關(guān)系洗板效果，可改變試劑濃度，對后續(xù)檢驗的準(zhǔn)確性具有重要影響。由于目前計時技術(shù)已達(dá)到毫秒或微秒水平，其以秒計時的誤差可忽略，故暫不考慮計時參數(shù)校準(zhǔn)。

根據(jù)洗板機的工作原理，其主要特點是小液體的反復(fù)加液和吸液，經(jīng)過一定工作時間后其負(fù)壓系統(tǒng)穩(wěn)定性會發(fā)生改變，吸液效果降低。使用中清洗頭難免會有污染，從而影響加液準(zhǔn)確性，而用戶無法自行檢測發(fā)生的變化，會對檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生較大影響。因而有必要采用科學(xué)合理的方法進(jìn)行校準(zhǔn)，根據(jù)洗板機特點，可參照國家檢定規(guī)程“移液器”(JJG646-2006)[2]中容量測量方法，采用衡量法進(jìn)行加液量和殘液量準(zhǔn)確性的校準(zhǔn)，此次主要校準(zhǔn)內(nèi)容為加液量的準(zhǔn)確性和殘留量以及通用要求。

2.1 主要技術(shù)要求

根據(jù)多數(shù)儀器技術(shù)指標(biāo)和《廣東省洗板機產(chǎn)品注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》(試行)[3]中主要技術(shù)要求為以下4項：①注液量最大允許誤差應(yīng)≤±5%；②注液量重復(fù)性應(yīng)≤2.5%；③吸液殘留量應(yīng)≤3 μl/孔；④吸液殘留量重復(fù)性應(yīng)≤1.5 μl/孔。

2.2 校準(zhǔn)條件

(1)室溫(20±5)℃且室溫變化應(yīng)＜1 ℃/h，相對濕度為40%～80%。不應(yīng)有明顯風(fēng)速和影響天平工作的振動，避免陽光照射，同時實驗室不應(yīng)有影響天平正常工作的磁場和振動，且周圍無腐蝕性氣體和液體。

(2)校準(zhǔn)介質(zhì)應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)“分析實驗用水規(guī)格和實驗方法”(GB6682-2008)要求[4]的蒸餾水或去離子水，其溫度與室溫應(yīng)≤2 ℃。

2.3 校準(zhǔn)設(shè)備

洗板機校準(zhǔn)所用設(shè)備選用Ⅰ級電子天平和分度值為0.01 ℃的數(shù)字溫度計。

2.4 校準(zhǔn)項目和校準(zhǔn)方法

(1)外觀檢查。被校準(zhǔn)的裝置不應(yīng)有影響正常工作的機械損傷，各控制開關(guān)靈活可靠，微孔板可穩(wěn)定放置于工作面且動作正常。

(2)注液量最大允許誤差和殘留量的校準(zhǔn)。盡量選擇單注液和單吸液方式，應(yīng)在覆蓋注液量范圍內(nèi)選取不少于兩個校準(zhǔn)點或根據(jù)客戶要求選取校準(zhǔn)點。校準(zhǔn)時選取相應(yīng)未使用的微孔板，稱量空板，反復(fù)洗板2次。分別稱量加液后和吸液后的質(zhì)量，每次稱量前應(yīng)用吸水紙吸附微孔板底部的水分，重復(fù)操作稱量6次。校準(zhǔn)過程中實驗用介質(zhì)溫度波動應(yīng)≤±1 ℃，目測微孔板注液面和殘留液面應(yīng)無明顯差異。每次稱量并計算注液量(公式1)和殘留量(公式2)：

式中VI為被檢儀器的注液量(μl)，VC為被檢儀器的殘留量(μl)，m1，m2，m3分別為天平稱量的空板、注液后和抽液后的微孔板質(zhì)量(mg)，k(t)為蒸餾水的溫度密度系數(shù)，N為選取測量的微孔數(shù)。

注液量相對誤差計算為公式3：

式中V0為設(shè)定注液量(μl)，為6次注液量的算術(shù)平均值(μl)。

(3)注液量和殘留量的重復(fù)性校準(zhǔn)。重復(fù)性計算為公式4：

式中Vi為每次測量的注液量或殘留量值為注液量或殘留量的算術(shù)平均值(μl)，n為測量次數(shù)。

(4)洗板機校準(zhǔn)中的功能選擇。校準(zhǔn)過程中不選用振動及浸泡功能，盡量避免沾帶水份，取出酶標(biāo)板后稱量應(yīng)迅速，以減少液體揮發(fā)，實驗證明在穩(wěn)定環(huán)境中，30 s的測量時間對稱量結(jié)果可忽略不計。隨時檢查廢液瓶中的廢液，應(yīng)該在廢液超出三分之二時，及時將廢液倒掉。

3 孵育溫度的校準(zhǔn)

3.1 技術(shù)要求

參照國家計量技術(shù)規(guī)范“環(huán)境試驗設(shè)備溫度、濕度校準(zhǔn)規(guī)范”(JJF1101-2003)[5]方法及儀器技術(shù)要求，溫控精度為±0.2 ℃，溫度波動性為±0.1 ℃。由于儀器樣品室空間較小，可選擇中心單點測量，溫度均勻性未做考慮。

3.2 校準(zhǔn)方法

將數(shù)字溫度計探頭置于孵育箱內(nèi)樣品中心位置，將儀器溫度設(shè)定到所需溫度，待儀器工作正常溫度顯示穩(wěn)定后開始讀數(shù)，每2 min記錄1次，30 min共測試15次。

3.3 溫度偏差計算

溫度偏差計算為公式5：

式中Δtd為溫度偏差(℃)，td為中心點n次測量的算術(shù)平均值(℃)，t0為設(shè)備顯示溫度的平均值(℃)。

3.4 溫度波動度計算

以30 min內(nèi)(2 min/次)樣品中心點實測最高溫度與最低溫度之差的一半，其計算為公式6：

式中Δtf為溫度波動度(℃)，t0max為中心點n次測量的最大值(℃)，t0min為中心點n次測量的最小值(℃)。

4 校準(zhǔn)中的注意事項

在吸光度校準(zhǔn)時應(yīng)避免采用振動模式，隨時注意標(biāo)準(zhǔn)濾光片是否有污染。為保證洗板機的性能可靠，使用中應(yīng)注意保護(hù)清洗頭，并注意與空板的位置是否偏移，樣品池在酶標(biāo)儀板中是否放置水平，酶標(biāo)板應(yīng)平穩(wěn)放置在載架中間。運行時要隨時檢查廢液瓶中的廢液，應(yīng)在廢液超出三分之二時及時將廢液倒掉。關(guān)機前用蒸餾水進(jìn)行至少5次清洗洗板機內(nèi)部操作，關(guān)機后將洗液瓶內(nèi)的洗液移出，避免結(jié)晶后堵塞洗板頭。如果洗板機較長時間不使用時，需將洗板頭拔下，泡于蒸餾水中。

5 結(jié)論

隨著醫(yī)療機構(gòu)近年來全自動酶免分析儀使用量的不斷增加，僅依據(jù)國家計量檢定規(guī)程“酶標(biāo)分析儀”(JJG861-2007)[1]對全自動酶免分析儀開展校準(zhǔn)工作已不能滿足實際檢測需求[6]。此次重點對全自動酶免分析儀吸光度、波長之外的洗板性能和溫度指標(biāo)校準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行了探討和完善。根據(jù)提供的方法，在實際校準(zhǔn)工作中可及時發(fā)現(xiàn)在用洗板機功能負(fù)壓系統(tǒng)的穩(wěn)定性變化、加液量準(zhǔn)確性以及殘留量的異常，指導(dǎo)客戶或維修單位及時查找原因排除故障，為保證臨床檢驗結(jié)果準(zhǔn)確提供良好的技術(shù)支持。