谷曉倩李 江*潘愛紅林學(xué)政

(1.自然資源部 第一海洋研究所 海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島266061；2.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院,山東 青島266061)

α-淀粉酶(α-1,4-glucan-4-glucanohydrolase；EC 3.2.1.1)是一種內(nèi)切葡糖苷酶,能夠特異性的作用于α-1,4糖苷鍵,從而將可溶的淀粉、糖原等大分子糖類物質(zhì)降解為糊精、麥芽糖以及葡萄糖等小分子量的還原糖,從而迅速降低了淀粉的黏度,起到液化作用,所以α-淀粉酶也稱為液化酶[1]。α-淀粉酶主要?dú)w屬于糖苷水解酶(Glycoside Hydrolase,GH)13,57和119家族,但絕大多數(shù)為GH13家族成員(http:∥www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html)。

α-淀粉酶廣泛地來源于動(dòng)物、植物和微生物,特別是微生物來源的α-淀粉酶由于生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)工藝簡單高效,因而廣泛地應(yīng)用于食品、紡織、發(fā)酵、造紙等領(lǐng)域[2-3]。目前,對(duì)來源于Bacillussp.的α-淀粉酶研究最為深入,主要是由于該類酶具有良好的熱穩(wěn)定性[4]。近年來,隨著對(duì)α-淀粉酶的工業(yè)應(yīng)用要求不斷提高,篩選和開發(fā)具有高催化活性、底物特異性、熱穩(wěn)定性、金屬離子和變性劑耐受性及廣泛p H適應(yīng)性的特殊催化特性的α-淀粉酶,成為工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)[5]。

在工業(yè)生產(chǎn)中,淀粉先要蒸煮糊化然后加入淀粉酶對(duì)其水解,但這種傳統(tǒng)方法會(huì)消耗大量的熱能進(jìn)而使其生產(chǎn)成本提高。近年來,采用常溫酶降解生淀粉的研究得到廣泛的關(guān)注,目前,已發(fā)現(xiàn)了多個(gè)能夠降解生淀粉的淀粉酶,這些酶能夠在低于淀粉糊化的溫度下直接對(duì)生淀粉進(jìn)行降解,該工藝有效地降低了能耗,簡化了操作流程,從而縮減了生產(chǎn)成本[6-7],因此在諸多工業(yè)領(lǐng)域顯示出重要的應(yīng)用前景。

南極海域不同于淡水、土壤等陸地環(huán)境,具有低溫、高鹽和強(qiáng)輻射等環(huán)境特征,生存于其中的微生物具有一些與其特殊環(huán)境相適應(yīng)的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)上的特異性,因而蘊(yùn)藏著大量功能獨(dú)特的低溫酶資源。目前,已報(bào)道的淀粉酶大多來自陸地和海洋微生物[8-12],而有關(guān)南極微生物的淀粉酶尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中,從南極沉積物中篩選獲得了大量具有產(chǎn)淀粉酶活性的南極菌株,采用高通量測序技術(shù)獲得了高產(chǎn)酶菌株P(guān)seudoalteromonassp.A211-5的全基因組數(shù)據(jù),篩選獲得了淀粉酶疑似序列amy3809,并對(duì)其進(jìn)行異源表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究,以期獲得具有潛在應(yīng)用前景的高活性、高穩(wěn)定性的α-淀粉酶。

1 材料和方法

1.1 菌株

產(chǎn)淀粉酶菌株P(guān)seudoalteromonassp.A211-5分離自第32次南極科考采集的阿蒙森海深海沉積物(128°08'42″W,71°53'55″S),純化的菌株保存于自然資源部第一海洋研究所菌種庫(-80℃)。

1.2 試劑和材料

蛋白胨(Oxoid)、酵母粉(Oxoid)；可溶性淀粉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；IPTG(Solarbio)；卡那霉素(Solarbio)；麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)樣品(Miragen)；E.coliBL21(DE3)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；表達(dá)載體p ET-30a(His·Tag)(Takara)；Ni Sepharose(GE Healthcare)；硅膠板(Merck KGa A)；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

3,5-二硝基水楊酸溶液:182 g四水合酒石酸鉀鈉溶解于600 m L蒸餾水中,加入21 g NaOH,6.3 g DNS,5 m L苯酚,5 g亞硫酸鈉,定容到1 000 m L容量瓶中,儲(chǔ)存于棕色瓶中；展開劑:根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求正丁醇、冰乙酸、蒸餾水按2∶1∶1的體積比配制；顯色劑:量取200 m L的丙酮于250 m L燒杯中,再加入4 g二苯胺,再加入4 m L的苯胺,20 m L的磷酸溶液,混勻后儲(chǔ)存于棕色瓶中備用。

1.3 α-淀粉酶amy 3809的克隆

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)

以全基因組測序獲得的淀粉酶基因amy3809完整ORF為模板,設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物(http:∥seq.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer)；分析序列的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),并在引物的5'端和3'端分別引入相應(yīng)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),特異性引物由金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成:上游引物TATGTATCCGCAGTACTGT-3')添加BamHI酶切位點(diǎn)；下游引物GCGCTGCTAAA-3')添加XbaⅠ酶切位點(diǎn)

1.3.2 PCR擴(kuò)增

以南極菌A211-5基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系(50μL):2×Taq PCR Master Mix(Tiangen)25μL,通用引物27F、1492R各1μL,細(xì)菌基因組DNA模板1μL,滅菌蒸餾水。

PCR擴(kuò)增程序:首先95℃預(yù)變性5 min,然后95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1.5 min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min,擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠進(jìn)行回收純化。

1.4 α-淀粉酶基因amy 3809的表達(dá)

1.4.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

采用Bam H I/Xba I內(nèi)切酶分別對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體p ET-30a進(jìn)行雙酶切,利用T4 DNA Ligase連接純化的目的基因和表達(dá)載體,從而構(gòu)建重組質(zhì)粒amy粒3809+p ET-30a,并將其轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。重組菌接種于含卡那霉素(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16 h,涂布平板篩選陽性克隆。提取陽性克隆的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)表達(dá)宿主,轉(zhuǎn)化的菌株涂布于LB固體平板(含50mg/L卡那霉素)于37℃培養(yǎng)24 h。

1.4.2 重組質(zhì)粒的鑒定

挑取在板上產(chǎn)生透明圈的重組菌,提取重組質(zhì)粒,采用雙酶切和測序兩種手段對(duì)重組質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行驗(yàn)證,測序由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司完成。

1.5 重組α-淀粉酶Amy3809的純化

按1%的接種量將重組菌接種在含卡那霉素(50 mg/L)的50 m L LB培養(yǎng)基中,37℃,150 r/min培養(yǎng)6～7 h；從50 m L液體培養(yǎng)基中取3 m L菌液加到300 m L的液體培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí),加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,16℃,125 r/min條件下培養(yǎng)24 h；經(jīng)過誘導(dǎo)的重組菌于4℃、9 000 r/min的條件下離心15 min,收集菌體；采用p H為7.0的PBS緩沖液重懸菌體,然后于4℃、10 000 r/min的條件下離心10 min,獲得粗酶液。

收集的粗酶液采用Ni-NTA His Tag Kit進(jìn)行純化[13],洗脫液為含有不同濃度咪唑 (40,80,120,160,200 mmol/L)的PBS緩沖液(p H=7.0),將不同濃度的洗脫液進(jìn)行合并,采用SDS-PAGE方法對(duì)重組蛋白的分子量和純度進(jìn)行鑒定。

1.6 重組α-淀粉酶Amy3809的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 酶活測定方法[14-15]

反應(yīng)體系為:1 m L粗酶液,1 m L底物(2 mg/m L淀粉溶于p H 7.0的磷酸緩沖液),50℃反應(yīng)30 min,采用DNS法測定水解產(chǎn)生的還原糖吸光值。酶活力單位定義:1 m L酶液在50℃和p H=7.0條件下1 min催化產(chǎn)生1μg還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行,取平均值。

1.6.2 重組α-淀粉酶Amy3809的性質(zhì)

分別在10,20,30,40,50,60和70℃的反應(yīng)溫度下測定酶活,以確定其最適反應(yīng)溫度；分別在40,50,60℃的條件下保溫0,1,2,3,4,5,12,24 h,然后測定其殘余酶活,確定該酶的熱穩(wěn)定性；分別采用不同p H范圍的緩沖液:NaAC-HAC(p H為4.0～5.0),Na2HPO4-Na H2PO4(p H為6.0～8.0),Gly-NaOH(p H為9.0～10.0),Na2HPO4-NaOH(p H=11.0),以測定其最適p H；分別配制含100 mmol/L EDTA,Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Cu2+,Ba2+,Sr2+,Mn2+,Ni2+,Fe2+,Fe3+的溶液,加入到稀釋酶液中使其終濃度達(dá)到5 mmol/L,以不加任何離子所測的酶活力定義為100%,以測定金屬離子對(duì)Amy3809的影響。

1.7 降解產(chǎn)物分析

將1 m L重組酶Amy3809與1 m L底物(2 mg/m L淀粉溶于p H 7.0的磷酸緩沖液)在50℃條件下反應(yīng)6 h,沸水浴10 min終止反應(yīng),離心備用。

1.7.1 薄層層析法(TLC)[16]

吸取一定量的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)樣品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品和反應(yīng)產(chǎn)物上清,點(diǎn)于硅膠板上放入加有15 m L展開劑的層析槽中進(jìn)行層析。在通風(fēng)櫥內(nèi)層析約6 h,取出風(fēng)干后用噴壺均勻噴灑顯色劑于硅膠板上,等待風(fēng)干后將硅膠板于90℃烤箱中烘烤10 min左右,直至樣品顯色效果明顯。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及序列分析

通過特異性引物克隆獲得的α-淀粉酶基因amy3809序列全長為1 866 bp,編碼619個(gè)氨基酸,預(yù)測其理論分子量為67 kDa。相似性比對(duì)結(jié)果表明,Amy3809與Amy Ac-3家族成員具有高度的相似性,與:α-amylase fuliginea(WP_033029470.1),α-amylase MelDa3(PLT24194.1),α-amylase ruthenica(WP_082079259.1)和αamylase S3431(WP_033039320.1)序列的相似性高達(dá)64%以上(圖1)。

圖1 Amy3809氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果Fig.1 Multiple sequences alignment of Amy3809 with known alpha-amylase

2.2 α-淀粉酶Amy3809的表達(dá)與純化

經(jīng)雙酶切和測序驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒amy3809+p ET-30a成功轉(zhuǎn)化到E.coliBL21.(DE3)(圖2)。SDSPAGE的結(jié)果表明,0.5 mmol/L的IPTG能夠顯著誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)量,且該重組酶可溶性表達(dá)的比例很高(圖3),同時(shí)也驗(yàn)證了目的基因,成功地實(shí)現(xiàn)了高效異源表達(dá)。

重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后可得到單一的蛋白條帶,其洗脫液中咪唑濃度為120 mmol/L。SDS-PAGE結(jié)果顯示重組酶Amy3809分子量約為70 k Da,與推測的理論分子量一致(67 k Da)。純化后的Amy3809經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)酶活測定方法測定,其比活力為343 U/mg。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果Fig.2 Double enzyme digestion of recombinant plasmids

圖3 Amy3809蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of Amy3809

2.3 重組酶Amy3809的性質(zhì)

純化后的重組酶Amy3809在溫度為50℃時(shí)呈現(xiàn)最高的酶活,且在10～40℃的范圍內(nèi)仍能保持85%以上的酶活,但當(dāng)反應(yīng)溫度升高為60℃時(shí),酶活顯著下降,70℃時(shí)幾乎失活,表明該酶具有良好的低溫耐受特性及熱敏感性(圖4)。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,該酶在低溫條件下具有較好的穩(wěn)定性,當(dāng)溫度為40℃時(shí),保溫24 h的條件下,仍可保持在50%以上的初始酶活；50℃保溫12 h,殘留酶活仍能達(dá)到50%以上；當(dāng)溫度升高到60℃時(shí),其穩(wěn)定性顯著下降。與大多低溫酶類似,α-淀粉酶Amy3809在低溫下較穩(wěn)定,隨著溫度的升高穩(wěn)定性顯著降低(圖5)。

圖4 溫度對(duì)重組酶Amy3809活性的影響Fig.4 The effect of temperature on the activity of Amy3809

圖5 溫度對(duì)重組酶Amy3809穩(wěn)定性的影響Fig.5 The effect of thermostability on Amy3809 at different temperatures and time points

Amy3809具有較廣的p H耐受范圍,其最適作用p H=7.0,但該酶在p H 5.0～10.0的范圍內(nèi),仍保持50%以上的初始活性(圖6)。

金屬離子對(duì)重組酶Amy3809的活性具有顯著的影響,如圖7所示,5 mmol/L Na+,K+,和Ca2+能夠提高重組酶Amy3809的活性,但Cu2+,Fe2+,Mg2+和EDTA則顯著降低α-淀粉酶Amy3809的活性,尤其是Cu2+,Fe2+和 Mg2+(圖7)。

圖6 p H對(duì)重組酶Amy3809活性的影響Fig.6 The effect of p H on the activity of Amy3809

圖7 金屬離子對(duì)重組酶Amy3809活性的影響Fig.7 The effects of metal ions and metal salts on the activity of Amy3809

2.4 酶解產(chǎn)物的分析

為驗(yàn)證重組酶Amy3809對(duì)可溶性淀粉的降解特性,我們采用薄層色譜(TLC)分析手段進(jìn)行了分析,結(jié)果如圖8所示。由圖8可見,重組酶Amy3809能夠有效地將可溶性淀粉降解為葡萄糖及不同聚合度的麥芽寡糖,其麥芽寡糖主要組成為麥芽四糖、麥芽三糖和麥芽糖。根據(jù)酶解產(chǎn)物的差異,可將α-淀粉酶分為兩類:糖化型α-淀粉酶和液化型α-淀粉酶。二者主要的差異在于,液化型α-淀粉酶最終酶解產(chǎn)物為寡聚糖和糊精,而糖化型α-淀粉酶則隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,除了有寡聚糖產(chǎn)生外,還會(huì)有葡萄糖終產(chǎn)物的產(chǎn)生。由圖8可見,經(jīng)過6 h的反應(yīng),重組酶Amy3809的終產(chǎn)物中檢測到大量的葡萄糖產(chǎn)物,因此,我們初步推測該酶為糖化型α-淀粉酶。

圖8 重組酶Amy3809降解產(chǎn)物的TLC分析Fig.8 TLC of the hydrolysis products of recombinan Amy3809

3 討 論

迄今為止,已有大量淀粉酶從海水、海洋沉積物、海藻、海洋軟體動(dòng)物、淡水和土壤等環(huán)境微生物中分離獲得,但多數(shù)已報(bào)道的淀粉酶活力低、穩(wěn)定性差,無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求[17],因此活性高、穩(wěn)定性好的中溫淀粉酶的篩選和發(fā)現(xiàn)仍具有重要意義。南極具有獨(dú)特的自然環(huán)境[18],因而孕育了豐富多樣的生命形態(tài),其在極端環(huán)境(如低溫、高壓、低營養(yǎng)輸入、無光)下的生存機(jī)制,造就了各種具有獨(dú)特生理活性的活性物質(zhì)和酶系[19-21]。本研究的α-淀粉酶基因amy3809來自于南極適冷菌(Pseudoalteromonassp.A211-5),目前有關(guān)南極微生物產(chǎn)淀粉酶的研究尚不多見,重組α-淀粉酶Amy3809的酶學(xué)性質(zhì)研究表明,該酶具有很好的低溫耐受及熱敏感特性、活性強(qiáng)、p H適應(yīng)性廣,因而具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

重組α-淀粉酶Amy3809的最適作用溫度為50℃,但隨著溫度的升高酶活迅速降低,70℃時(shí)幾乎失活,表明該酶具有良好的低溫耐受特性及熱敏感性,據(jù)此推測此特性應(yīng)該與其來源地南極生境相符。本研究結(jié)果略低于已有的中溫α-淀粉酶,如劉洋等[16]和Sodhi等[22]報(bào)道從芽孢桿菌分離的α-淀粉酶最適反應(yīng)溫度為55℃；而Igarash等[23]和黃彥超等[24]報(bào)道的α-淀粉酶最適反應(yīng)溫度為60℃。中溫酸性的α-淀粉酶在啤酒釀造以及淀粉糖漿行業(yè)中都具有顯著的應(yīng)用優(yōu)勢,首先,酸性淀粉酶能夠與糖化酶協(xié)同作用增加淀粉的水解效率；其次,中溫淀粉酶能夠在較低的反應(yīng)溫度下進(jìn)行淀粉降解,節(jié)能降耗；此外,中溫淀粉酶也更容易滅活。因此,中溫α-淀粉酶的開發(fā)和應(yīng)用勢在必行[25]。Amy3809的最適p H為7.0,且在p H在5.0～10.0的范圍之內(nèi)仍保持著較高的酶活,具有廣泛的酸堿耐受性,該特性與已報(bào)到的α-淀粉酶Amy WQJ以及菌株825產(chǎn)的α-淀粉酶p H適應(yīng)性相一致[26-27],由于該酶具有良好的酸堿耐受性,因此具有潛在的工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用前景。

金屬離子通常會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響,在研究中Ca2+,K+,Na2+能夠顯著地提高Amy3809的酶活,該結(jié)果也與已有的報(bào)道相一致[27-29],很多海洋微生物來源的酶在Ca2+的作用下酶活能夠得到提到,推測可能是因?yàn)镃a2+與酶中的特定氨基酸的羰基形成的配位鍵,對(duì)于穩(wěn)定酶分子的三維結(jié)構(gòu)起到了重要作用,該結(jié)果也與α-淀粉酶Amy3809產(chǎn)生菌的生境特征相符合；而Cu2+,Fe2+和Mg2+可能是通過與Ca2+競爭活性中心的結(jié)合位點(diǎn),從而抑制其活性,而該酶確切的催化機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

重組α-淀粉酶Amy3809能夠有效地將可溶性淀粉降解為麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖等小分子的寡糖和單糖,該結(jié)果也與已有的報(bào)道相似,α-淀粉酶Amy WQJ水解木薯淀粉的終產(chǎn)物為麥芽六糖和麥芽七糖,還有其他不同聚合度的糊精[26]；α-淀粉酶r BD5063水解可溶性淀粉,隨時(shí)間延長緩慢釋放低聚寡糖、麥芽糖和葡萄糖,水解17 h后,釋放大量低聚寡糖[30]；α-淀粉酶Amy H水解淀粉的第1個(gè)明顯的寡聚麥芽糖產(chǎn)物是麥芽三糖,最終產(chǎn)物為多種低聚麥芽寡糖[31]。

鑒于α-淀粉酶Amy3809低溫耐受及熱敏感特性,以及廣泛的p H耐受范圍,加之高效的可溶性表達(dá),使得該酶在洗滌、食品、污水處理等行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景,該研究也為南極微生物資源的開發(fā)利用提供了新思路。

4 結(jié) 語

本文對(duì)來自南極Pseudoalteromonassp.A211-5的α-淀粉酶基因Amy3809進(jìn)行了克隆表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明,異源表達(dá)的重組α-淀粉酶Amy3809的最適作用溫度為50℃、最適作用p H為7.0,且該酶具有良好的低溫耐受和熱敏特性以及較寬泛的p H適應(yīng)范圍；金屬離子Na+,K+和Ca2+能夠激活重組α-淀粉酶Amy3809的活性,而Cu2+,Fe2+,Mg2+和EDTA則對(duì)其活性具有抑制作用；且該酶能夠有效地將可溶性淀粉降解為麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖。綜上可見,α-淀粉酶Amy3809具有良好的低溫耐受和熱敏特性以及較廣的p H耐受范圍,能夠有效地將淀粉降解為低聚糖和葡萄糖,因此在工業(yè)生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。