(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210023)

原產(chǎn)墨西哥的辣椒(Capsicumspp.)是深受世人青睞且種植多、使用廣、產(chǎn)消較大的調(diào)味作物,其主要辣味物質(zhì)為辣椒堿[1],辣椒堿含量是衡量和鑒定辣椒品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。我國(guó)是世界上最大的辣椒生產(chǎn)、消費(fèi)和出口國(guó),近3年辣椒出口量增長(zhǎng)25%以上,貿(mào)易量占全球的20%以上[2]。辣椒堿具有優(yōu)異的抗氧化[3-4]、抗菌[5]和抗癌[6]等生物學(xué)活性,良好的測(cè)定方法也將有助于對(duì)具有不同含量辣椒堿的原料進(jìn)行初步鑒定。因此,尋求一種能快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)辣椒堿的方法便具有一定的意義。

對(duì)于辣椒堿的檢測(cè),現(xiàn)有的色譜法和質(zhì)譜法存在測(cè)定成本高和耗時(shí)等問題[7-8],光譜法則存在選擇性和準(zhǔn)確度不高等問題[9],相比之下電化學(xué)法具有快速便捷和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[10-11],能夠準(zhǔn)確安全地測(cè)定辣椒堿。依據(jù)循環(huán)伏安法的正(反)向掃描的氧化(還原)峰電流ipk(ipa)的圖形特征和峰值大小,可判斷此氧化(還原)電對(duì)的特性及其相對(duì)含量。Manaia等[12]研究表明辣椒堿在正向掃描時(shí),其苯環(huán)上的酚羥基易失去電子而生成氧化態(tài)(醌),且其氧化特征峰ipk大小與反應(yīng)體系中辣椒堿含量成正相關(guān),據(jù)此可通過測(cè)得其ipk值求得測(cè)定體系中辣椒堿含量[13]。但該研究只對(duì)辣椒堿在各種電化學(xué)方法上的行為進(jìn)行了定性研究,并未對(duì)循環(huán)伏安法定量測(cè)定辣椒堿進(jìn)行詳細(xì)分析和優(yōu)化。此外,采用納米粒子修飾工作電極將有助于提升對(duì)辣椒堿的選擇性和靈敏性,但修飾物的成本均較高[14-15]。

本文首先采用自制β-環(huán)糊精碳糊電極和玻碳電極對(duì)辣椒堿純品進(jìn)行了循環(huán)伏安掃描,在比較峰型和靈敏度后,選擇檢測(cè)性能較好的β-環(huán)糊精修飾碳糊電極作為本研究的工作電極,依次考察了不同緩沖體系、電壓掃描速率、體系離子強(qiáng)度、電解質(zhì)種類、溫度和干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響。在確定相關(guān)最佳條件后,得出了最佳條件下的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限,并考察了方法的精密度、實(shí)樣和加標(biāo)回收率,旨在為以電化學(xué)法快速簡(jiǎn)便測(cè)定辣椒堿技術(shù)提供支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

越南小米辣、貴州燈籠椒 明氏誠(chéng)信辣業(yè)店;印度魔鬼椒、河南小椒 小兩口干貨特產(chǎn)店;江西甜椒 好美優(yōu)品店提供;山東小米 辣沂蒙農(nóng)家味道店;以上共6個(gè)品種的10個(gè)干鮮辣椒試樣分兩個(gè)批次購(gòu)得;辣椒堿、辣椒色素 AR,西安維珍生物科技有限公司;維生素C、葡萄糖等其他試劑 AR,國(guó)藥試劑公司產(chǎn);測(cè)定用水 自制超純水。

MetrohmAutolab PGSTAT101(配NOVA 2.1.3數(shù)據(jù)處理軟件)電化學(xué)工作站 瑞士萬通公司;玻碳電極、銅電極、鉑絲電極、銀/氯化銀(Ag/AgCl)參比電極 天津艾達(dá)恒晟科技有限公司;232-01型甘汞參比電極 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;XW-80A旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;202-00BS真空干燥箱 上海力辰科技有限公司;ME204T/02電子分析天平 梅特勒-托利多國(guó)際有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理 將購(gòu)買的辣椒樣品除蒂除雜后,計(jì)量并在55 ℃真空干燥箱中烘干4～8 h,粉碎過60目篩,計(jì)量、裝瓶備用。取粉碎好的試樣按文獻(xiàn)[16]的方法以料液比1∶20 (m/V)加入無水乙醇于超聲功率200 W、頻率40 Hz和50 ℃下連續(xù)提取1.5 h;提取液趁熱用3#砂芯濾器迅速抽濾,冷卻后裝瓶于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 采用循環(huán)伏安法測(cè)定辣椒堿 用無水乙醇配得的辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-4～1.0 mmol/L),在合適的支撐溶液和緩沖溶液體系中,以飽和甘汞電極為參比電極、鉑電極為輔助電極和玻碳電極或自制改良修飾碳糊電極為工作電極的三電極工作體系于電化學(xué)工作站上在一定的掃描電壓、掃描速率下進(jìn)行循環(huán)伏安模式的掃描,測(cè)定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。然后取一定量的試樣備用液,按此法測(cè)得試樣中辣椒堿的含量。

1.2.3 測(cè)定條件的選擇

1.2.3.1 電極的選擇 在底液KCl 0.10 mol/L,辣椒堿2.50 mmol/L,Britton-Robison緩沖體系,pH11,20 ℃,掃描電壓速率100 mV/s條件下,經(jīng)比較測(cè)量電極的特性和適用性[17-21]并結(jié)合實(shí)情,以飽和甘汞電極為參比電極,鉑電極為輔助電極,通過自制修飾碳糊電極與玻碳電極的比對(duì)試驗(yàn)確定適宜工作電極。

修飾碳糊電極的自制方法:在文獻(xiàn)[17-19]的基礎(chǔ)上針對(duì)實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)做改良,即處理好的石墨粉∶β-環(huán)糊精=10∶1 (m/m)組成混合粉末,再按1.5 g/mL的比例加入液體石蠟后于旋渦混合儀混合5～8 min(邊加邊混合)得均勻糊狀物,并緩慢注入特制聚四氟乙烯管中(用真空法以確保其無氣泡),蓋上油紙壓實(shí),用膜將電極表面打磨至有明顯金屬光澤即成。

1.2.3.2 緩沖溶液體系及其pH的選定 在調(diào)研的基礎(chǔ)上[10-11],以β-環(huán)糊精修飾碳糊電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑電極為輔助電極,底液KCl 0.10 mol/L,辣椒堿2.50 mmol/L,掃描電壓速率100 mV/s,20 ℃條件下,對(duì)磷酸鉀-磷酸氫二鉀(K3PO4-K2HPO4)、磷酸鈉-磷酸氫二鈉(Na3PO4-Na2HPO4)、碳酸鉀-碳酸氫鉀(K2CO3-KHCO3)、硼砂緩沖液和Britton-Robison緩沖液的比較,尋得適宜緩沖溶液體系及pH值。

1.2.3.3 其它因素測(cè)定條件的選定方法 在β-環(huán)糊精修飾碳糊電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極、鉑電極為輔助電極,辣椒堿2.50 mmol/L,Britton-Robison緩沖體系pH11下,采取單因素法分別對(duì)電壓掃描速率、調(diào)節(jié)劑種類、測(cè)量體系離子強(qiáng)度和溫度等4個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn),通過測(cè)得其工作電流與掃描電壓(i～V)曲線的圖形和ipk值來確定測(cè)定的適宜條件。

1.2.3.4 選擇性試驗(yàn)的方法 為消除測(cè)定體系干擾物的影響,以循環(huán)伏安掃描圖的特征峰及峰形特征來判斷其影響,并根據(jù)所測(cè)辣椒試樣中可能存在的干擾物質(zhì)為維生素C、葡萄糖和辣椒色素,所以選擇性試驗(yàn)方法為:在所得的適宜條件下,采用添加試樣中存在的維生素C、葡萄糖和辣椒色素的1～20倍量進(jìn)行測(cè)試。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢測(cè)限的測(cè)定 在適宜條件下,取辣椒堿標(biāo)液(ccp)分別為10.0、1.0、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4mmol/L,測(cè)得其i～V曲線及ipk值。依此得到辣椒堿測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)其斜率(k)和空白值測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差(Sb)求得其檢測(cè)限(LODs=3Sb/k)[22]。

1.2.4.2 方法精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定 方法的精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示。方法準(zhǔn)確度用加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的回收率和RSD以及與高效液相色譜法(HPLC)[7,23]測(cè)定結(jié)果的比較來共同表示。

1.2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定 在適宜條件下,按1.2.1制得的10個(gè)樣液分別用循環(huán)伏安法和HPLC法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)Nova 2.3.1測(cè)得的循環(huán)伏安數(shù)據(jù),用Excel 2017繪圖,用SPSS 19.0做統(tǒng)計(jì)處理,且結(jié)果以“平均值±SD”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 工作電極的確定

按1.2.3.1方法在只改變工作電極下,所得結(jié)果見圖1。

圖1 玻碳電極和β-環(huán)糊精修飾碳糊電極的比較Fig.1 Comparison of glassy carbon electrode and carbon paste electrode modified by β-cyclodextrin

由圖1知,玻碳電極的氧化峰不很明顯,與β-環(huán)糊精修飾碳糊電極相比,對(duì)辣椒堿的靈敏度較低,而β-環(huán)糊精修飾碳糊電極測(cè)得的氧化峰十分突出,且峰形頗好,故選β-環(huán)糊精修飾碳糊電極做工作電極。

2.2 緩沖溶液體系及其酸度對(duì)ipk的影響

按1.2.3.2方法在pH11條件下,僅改變緩沖體系,測(cè)得結(jié)果見表1。

由表1知,在考察的5種緩沖溶液中以Britton-Robison緩沖體系的ipk最大,且RSD=1.1%,表明Britton-Robison緩沖體系很適合本測(cè)定方法及其體系。因此,選取Britton-Robison緩沖體系為佳。

表1 緩沖溶液體系對(duì)ipk的影響(n=3)Table 1 Influence of buffer systems on ipk(n=3)

按1.2.3.2方法在Britton-Robison緩沖體系下,僅改變體系pH,測(cè)得峰電流結(jié)果見圖2。

圖2 pH與ipk的線性關(guān)系Fig.2 Linear correlations between pH with ipk

由圖2知,體系pH與ipk間呈強(qiáng)正相關(guān)(ipk=0.9673pH-1.7997,R2=0.9835),且當(dāng)pH11時(shí),ipk最大,反應(yīng)易發(fā)生程度和測(cè)定靈敏度都最佳,故選擇緩沖溶液體系的酸度為pH11。

2.3 電壓掃描速率對(duì)ipk的影響

按1.2.3.3方法在底液KCl 0.10 mol/L,20 ℃下,僅改變掃描電壓速率,所得結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 不同掃描速率下工作電流的變化Fig.3 Changes of working current under different scan rates

圖4 掃描速率與ipk的線性關(guān)系Fig.4 Linear correlations between scan rate with ipk

圖3反映出電壓掃描速率越高ipk值越大,但掃描速率≥200 mV/s時(shí),會(huì)出現(xiàn)電極表面迅速沉積而使循環(huán)伏安曲線重現(xiàn)性破壞。雖然當(dāng)電壓掃描速率100 mV/s時(shí),其ipk值不是最大,但它有良好氧化峰形(如圖3)和頗佳的重現(xiàn)性(RSD≤1.1%),且單次循環(huán)掃描時(shí)間也短。因此,電壓掃描速率以選100 mV/s為宜。另外,由圖4得知,電壓掃描速率(v)與ipk間線性關(guān)系良好(當(dāng)v=0～50 mV/s時(shí),線性方程為ipk=0.0971v+0.9084,R2=0.9882;當(dāng)v=50～500 mV/s時(shí),線性方程為ipk=0.0486v+3.5634,R2=0.9958;且高掃描速率下的線性更好些)。

2.4 體系離子強(qiáng)度對(duì)ipk的影響

按1.2.3.3方法在掃描電壓速率100 mV/s、20 ℃,僅改變體系離子強(qiáng)度下,所得結(jié)果見表2。

表2 離子強(qiáng)度對(duì)ipk的影響(n=3)Table 2 Influence of ionic strength on ipk(n=3)

由表2知,當(dāng)體系離子強(qiáng)度(IS)為0.20 mol/L(調(diào)節(jié)劑KCl濃度為0.10 mol/L)時(shí),ipk最大,表明此時(shí)電極反應(yīng)極易發(fā)生。因此,取IS=0.20 mol/L(調(diào)節(jié)劑KCl為0.10 mol/L)為宜。

2.5 電解質(zhì)種類對(duì)ipk的影響

按1.2.3.3方法在IS=0.20 mol/L,掃描電壓速率100 mV/s,20 ℃,只改變體系電解質(zhì)種類下,測(cè)得結(jié)果見表3。

表3 電解質(zhì)種類對(duì)ipk的影響(n=3)Table 3 Influence of electrolyte species on ipk(n=3)

由表3知,在相同離子強(qiáng)度下,以調(diào)節(jié)劑KCl組的ipk最大,反應(yīng)的進(jìn)行和達(dá)到平衡都更易。故選用KCl作離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑為佳。

2.6 測(cè)定溫度對(duì)ipk的影響

按1.2.3.3方法在底液KCl 0.10 mol/L,掃描電壓速率100 mV/s,20 ℃,只改變體系溫度下,測(cè)得結(jié)果見表4。

表4 測(cè)定溫度對(duì)ipk和Epk的影響(n=3)Table 4 Influence of temperature on ipk and Epk(n=3)

2.7 干擾物質(zhì)對(duì)ipk的影響

辣椒中除辣椒堿外,在50 ℃乙醇超聲提取可溶出物中可能影響本法對(duì)辣椒堿測(cè)定的成分有:維生素C、辣椒色素及可溶性糖[24]。為了解其影響,在適宜條件下按1.2.3.4方法所做選擇性試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 干擾物質(zhì)對(duì)辣椒堿測(cè)定的影響(n=3)Table 5 Influence of interfering substances on determination of capsaicin(n=3)

從表5可看出,在適宜條件下,添加的干擾物未達(dá)到飽和時(shí),其循環(huán)伏安掃描圖(如圖5)與圖1無差異,未增加新的特征峰,對(duì)辣椒堿原有特征ipk的峰形和峰值未產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響,其ipk的絕對(duì)誤差為-2.53～3.75 μA,相對(duì)誤差(Er)均不超過0.94%?？梢娫嚇又懈蓴_物的存在并不影響測(cè)定,所以實(shí)樣測(cè)定時(shí)無需額外采取消除干擾的措施。

圖5 添加的干擾物對(duì)ipk的影響(n=3)Fig.5 Influence of additional disturbances on ipk(n=3)

2.8 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與檢出限的測(cè)定

在適宜條件下按1.2.4.1方法所測(cè)得結(jié)果見圖6。

由圖6得到,辣椒堿濃度(ccp)為1.0×10-4～10.0 mmol/L內(nèi)ccp與ipk的方程為ipk=3.1046Ccp+1.0025(R2=0.9946),線性關(guān)系良好。依ipk～ccp工作曲線經(jīng)求算此條件下測(cè)定辣椒堿的檢測(cè)限LOD=0.125×10-3mmol/L(0.3817 μg/mL),此結(jié)果與Ferraz等[20]用HPLC法的結(jié)果相當(dāng)。但當(dāng)ccp較高時(shí),會(huì)使碳糊電極表面較快地被反應(yīng)產(chǎn)物所覆蓋物,致使其電阻增加而電流降低最終導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)較大偏差;可通過稀釋測(cè)定本底液的方法確保測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

2.9 精密度的測(cè)定

在適宜條件下按1.2.4.2方法所測(cè)得結(jié)果見圖7。

圖7 辣椒堿測(cè)定的穩(wěn)定性(n=3)Fig.7 Stability of determination of capsaicin(n=3)

由圖7可知,在適宜條件下用本法測(cè)定辣椒堿標(biāo)液的ipk值受時(shí)間的影響甚小,在測(cè)試的48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD≤1.8%),特別是半小時(shí)內(nèi)ipk值都幾乎恒定。但隨時(shí)間的延長(zhǎng)ipk值呈前穩(wěn)中升后略降的變化態(tài)勢(shì)。產(chǎn)生這樣變化的原因和機(jī)理有待進(jìn)一步探究。

2.10 實(shí)樣和加標(biāo)回收率的測(cè)定

在適宜條件下對(duì)市售兩個(gè)批次(A、B)10種辣椒試樣的測(cè)定結(jié)果如表6、表7所示。

表7 10種辣椒實(shí)樣的加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 7 Recovery rate of standard addition of 10 kinds of capsicum(n=3)

由表6知,在適宜條件下,10種辣椒樣中辣椒堿含量的測(cè)定結(jié)果顯示,本法與HPLC法相當(dāng)吻合,與文獻(xiàn)報(bào)道[25-26]也一致。且從表7可見實(shí)樣的加標(biāo)回收率為100.70%～109.89%(平均103.71%),RSD為1.1%～4.9%?？梢姳痉▽?duì)辣椒中辣椒堿的測(cè)定準(zhǔn)確可靠,能應(yīng)用于實(shí)際。另外從表6、表7中還知:干辣椒中辣椒堿含量高于新鮮辣椒;辣椒品種不同其辣椒堿含量差異很大;同品種辣椒熱帶地區(qū)的印度、越南辣椒堿含量高于非熱帶地區(qū)的河南、山東。這可為需求辣椒堿含量不同的辣椒提供了參考。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)確定了循環(huán)伏安法測(cè)定辣椒堿的條件,并對(duì)測(cè)定參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。采用β-環(huán)糊精修飾碳糊電極的循環(huán)伏安法測(cè)定辣椒堿的適宜條件為:電壓掃描速率為100 mV/s,pH11,離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑為0.10 mol/L KCl濃度控制為0.20 mol/L,測(cè)定溫度約20 ℃,在30 min內(nèi)結(jié)果恒定(RSD≤0.1%)且48 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性良好(RSD≤1.8%)。該法的LOD 0.3817 μg/mL,且Ccp在1.0×10-4～1.0 mmol/L內(nèi)與ipk呈極佳正相關(guān)線性關(guān)系,其方程為ipk=3.1046Ccp+1.0025,R2=0.9946。加標(biāo)回收率為100.70%～109.89%(平均103.71%)。另外,本法不受辣椒試樣內(nèi)物質(zhì)的干擾,測(cè)定選擇性高,前處理簡(jiǎn)單,測(cè)定速度快,靈敏度較高,可作為辣椒堿含量的定量分析方法。且本法有適合自動(dòng)化和智能化快捷在線檢測(cè)的潛能。