彭建明，朱扣柱，葉記林，蘇蘭娣，戴友愛

蛇床子素（Osthole）即7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，可以從蛇床子等多種中草藥中提取純化。眾所周知，蛇床子素在中醫(yī)藥中長期用于治療皮膚瘙癢、濕疹、陰道毛滴蟲感染和性功能障礙。多項研究顯示，蛇床子素具有抗炎［1］、抗心肌缺血［2］、抗氧化［3］、抗肝損傷［4］等多種生物學功能。最近的研究顯示，蛇床子素具有抗癌功能［5］。蛇床子素對多種類型的癌癥有顯著的抑制作用，包括肝癌、白血病、胃癌、乳腺癌等［5］。因此，迄今為止進行的眾多研究表明蛇床子素具有抑制惡性腫瘤進展的潛力。然而，

關(guān)于蛇床子素抗肺癌的機制尚未闡明。本研究旨在觀察蛇床子素在人肺癌細胞H1299 中的作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌H1299 細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。蛇床子素（純度98%，上海詩丹德生物公司），用二甲基亞砜（DMSO）配成200 mmol/L 的貯存液；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）為AMRESO 產(chǎn)品；Annexin V-碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司；B淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、磷酸化NF-κB（pNF-κB）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自美國Santa Cruz 公司；辣根過氧化酶標記二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜購自美國millipore公司；化學發(fā)光試劑盒購于美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞H1299 接種于DMEM 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL，接種于96 孔板中，每孔100 μL。24 h 后加入不同劑量（20、40、60、80、100、120、140和160 μmol/L）的蛇床子素，溶劑對照組加等體積的0.1%DMSO，同時設(shè)不加細胞只加培養(yǎng)液的孔為空白對照組。終止培養(yǎng)前4 h 每孔加入10μL MTT。培養(yǎng)4 h 后，吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO 溶解反應(yīng)產(chǎn)物，在酶標儀上檢測492 nm 光密度（OD）值。細胞生存率=OD藥物組/OD溶劑對照組×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 根據(jù)細胞增殖實驗結(jié)果，蛇床子素選擇較高濃度（40、80、120和160μmol/L）進行細胞凋亡實驗。將各處理組細胞（作用48 h后）用胰酶消化，離心收集細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后用500μL Binding buffer 重懸細胞，并加入Annexin V 和PI 輕輕混勻，室溫避光孵育15 min 后，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡比例。

1.2.4 Western blot 法檢測 Bcl-2、Bax 和 NF-κB 磷酸化的影響 取經(jīng)蛇床子素處理48 h后的細胞提取總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取20μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，5%牛奶室溫封閉1 h，加入一抗（1∶1 000 稀釋）于4 ℃孵育過夜，洗膜并加入二抗（1∶2 000 稀釋），室溫溫育1.5 h，利用化學發(fā)光試劑盒及膠片曝光進行檢測。應(yīng)用Image J 軟件進行分析，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值作為蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用One-way ANOVA 檢驗，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對肺癌細胞H1299 增殖的影響 從40μmol/L起，蛇床子素對H1299細胞的增殖均顯示出明顯的抑制作用，而且隨藥物濃度的增加，其抑制作用呈逐漸增強趨勢（F=388.524，P＜0.01），見圖1。

Fig.1 The inhibitory effect of osthole on the cell proliferation of H1299 cells圖1 蛇床子素對H1299細胞增殖的抑制作用

Fig.2 Osthole induced the cell apoptosis of H1299 cells圖2 蛇床子素誘導H1299細胞凋亡

2.2 蛇床子素對H1299 細胞凋亡的影響 見圖2。據(jù)2.1結(jié)果，選擇40、80、120和160 μmol/L 蛇床子組進行后續(xù)實驗。40、80、120 和160 μmol/L 蛇床子素處理H1299 細胞48 h 后其凋亡率分別為（7.5±0.9）%、（15.9±2.4）%、（26.9±1.6）%和（52.0±2.6）%，其中80、120 和160 μmol/L 蛇床子素組均高于溶劑對照組（6.8±1.1）%（F=359.507，P＜0.01）。

2.3 蛇床子素對H1299 細胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達的影響 與溶劑對照組比較，除40μmol/L組以外的各蛇床子素處理組Bcl-2蛋白表達量均下降，而Bax蛋白表達量均明顯升高，且具有劑量依賴性（P＜0.01），見表1、圖3。

Tab.1 The effect of osthole on the expressions of Bcl-2 and Bax proteins in H1299 cells表1 蛇床子素對H1299細胞內(nèi)Bcl-2和Bax表達的影響 （n=3，%，）

Tab.1 The effect of osthole on the expressions of Bcl-2 and Bax proteins in H1299 cells表1 蛇床子素對H1299細胞內(nèi)Bcl-2和Bax表達的影響 （n=3，%，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與40 μmol/L 組比較，c與80 μmol/L組比較，d與120 μmol/L組比較，P＜0.05；表2同

組別溶劑對照組40μmol/L組80μmol/L組120μmol/L組160μmol/L組F Bcl-2 100.0±5.0 98.0±1.0 83.3±4.2ab 74.0±2.6abc 33.0±5.0abcd 146.991＊＊Bax 100.0±4.0 114.0±3.6a 151.0±3.6ab 170.0±3.0abc 183.7±4.7abcd 262.539＊＊

Fig.3 The effect of osthole on the expression levels of Bcl-2 and Bax proteins in H1299 cells圖3 蛇床子素對H1299細胞內(nèi)Bcl-2和Bax表達的影響

2.4 蛇床子素對H1299 細胞NF-κB 信號通路的影響 80、120、160 μmol/L 組的蛇床子素能顯著抑制pNF-κB 的表達，且隨著蛇床子素濃度的不斷升高，H1299 細胞內(nèi)pNF-κB 水平降低越明顯（P＜0.05），而對NF-κB表達無明顯影響，見表2、圖4。

Tab.2 The effect of osthole on the expression levels of pNF-κB and NF-κB proteins in H1299 cells表2 蛇床子素對H1299細胞內(nèi)pNF-kB和NF-κB表達的影響 （n=3，%，）

Tab.2 The effect of osthole on the expression levels of pNF-κB and NF-κB proteins in H1299 cells表2 蛇床子素對H1299細胞內(nèi)pNF-kB和NF-κB表達的影響 （n=3，%，）

組別溶劑對照組40μmol/L組80μmol/L組120μmol/L組160μmol/L組F pNF-κB 100.0±6.0 96.7±1.5 92.7±2.1ab 83.0±1.0abc 75.3±1.5abcd 33.797＊＊NF-κB 100.0±3.0 98.3±3.5 101.3±3.5 97.3±2.1 95.7±2.1 1.744

Fig.4 The effect of osthole on the expression of NF-κB signaling in H1299 cells圖4 蛇床子素對H1299細胞內(nèi)NF-κB通路蛋白表達的影響

3 討論

在中國傳統(tǒng)的中草藥中，蛇床子素很早就被用于治療濕疹、皮膚性瘙癢等多種疾病。既往多項研究也顯示，蛇床子素對肝癌［5］、胃癌［6］、宮頸癌［7］、胰腺癌［8］、腎癌［9］等多種癌癥具有顯著的治療效果。然而，蛇床子素對肺癌細胞H1299 的作用及其分子機制尚不明。本研究結(jié)果顯示，從40μmol/L 始起，蛇床子素對H1299細胞的增殖均顯示出明顯的抑制作用，且蛇床子素能劑量依賴性地抑制人肺癌H1299細胞增殖并誘導其凋亡，其可能的作用機制與促進激活促凋亡因子Bax的表達、抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達以及下調(diào)pNF-κB的表達有關(guān)。

研究表明，Bcl-2和Bax蛋白是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白［10］，其中Bcl-2發(fā)揮了抑制凋亡的作用，而Bax則起著促進凋亡的功能，這2種蛋白的功能是相反的。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白一般定位于線粒體外膜上，可以阻止線粒體釋放細胞色素C 等多種促凋亡因子［11］。此外，Bcl-2蛋白還可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，進而維持細胞的穩(wěn)定性來抑制凋亡［11］。而在線粒體外膜上的Bax蛋白在各種促凋亡因素的刺激下于線粒體外膜上形成一個細胞色素C 的通道，促進細胞色素C的釋放，繼而通過caspase 通路導致凋亡的產(chǎn)生［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，當蛇床子素（80、120和160 μmol/L）作用于H1299 細胞后，Bax 蛋白表達水平明顯升高，而Bcl-2蛋白的表達水平明顯降低，提示蛇床子素通過下調(diào)Bcl-2 的表達和上調(diào)Bax 的表達來誘發(fā)細胞凋亡。

NF-κB是一類能與多種基因的啟動子或增強子結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［12］。NF-κB是由亞單位p50和p65組成的異源二聚體，其中p50可以結(jié)合到DNA 上，p65 的轉(zhuǎn)錄活性比較強。在正常的生理條件下，NF-κB 與IκB-α 結(jié)合后分布于細胞質(zhì)中，在外界信號作用下NF-κB 與IκB-α 蛋白解離，并進入細胞核來促進和激活多種靶基因，從而發(fā)揮其生物學功能［13］。多項研究顯示，NF-κB 能促進多種抗凋亡基因的表達，主要是因為這些抗凋亡基因的啟動子上存在NF-κB的結(jié)合位點，因而NF-κB能夠通過這些基因的表達產(chǎn)物來抑制細胞凋亡［14］。在本研究中，蛇床子素能呈劑量依賴性地抑制pNF-κB 的表達，但不影響NF-κB 的表達，提示蛇床子素可能能夠抑制NF-κB信號通路，這可能是蛇床子素誘導肺癌細胞凋亡的機制之一。

綜上所述，蛇床子素通過促進激活肺癌細胞H1299 中促凋亡因子Bax，抑制抗凋亡因子Bcl-2 和抑制NF-κB 信號通路，經(jīng)過級聯(lián)反應(yīng)，誘導細胞凋亡。