許 濤 魏中鋒 樊祜卿 孟菊梅

（①山東省單縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 274300②山東省菏澤市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ③山東省菏澤市動(dòng)物衛(wèi)生技術(shù)中心）

構(gòu)樹是一種優(yōu)質(zhì)的天然植物蛋白飼料，有研究證明構(gòu)樹葉中粗蛋白含量高達(dá)18%～24%，近年來生物技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)樹有望被開發(fā)成一種新型蛋白質(zhì)飼料[1-3]。通過篩選構(gòu)樹發(fā)酵菌株，提高發(fā)酵過程中蛋白酶、纖維素酶、單寧酶含量，降解其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子和粗纖維，提高構(gòu)樹營養(yǎng)利用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 菌株分離篩選的培養(yǎng)基及儀器

1.1.1 培養(yǎng)基 纖維素酶篩選培養(yǎng)基、蛋白酶篩選培養(yǎng)基、單寧酶篩選培養(yǎng)基按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[4]中的配方配制。

1.1.2 儀器 JC-ST-06脂肪測(cè)定儀(上海精密儀器儀表有限公司)、SLQ-6型粗纖維測(cè)定儀(上海纖檢儀器有限公司)、BOXUN潔凈工作臺(tái)(北京市西城區(qū)半導(dǎo)體設(shè)備一廠)、SM-5顯微鏡(日本尼康)、DSX-280KB24立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安)、DWS-250型生化培養(yǎng)箱(江蘇達(dá)沃斯機(jī)械科技有限公司)、XDS-100C三目倒置顯微鏡(奧林巴斯)、SX2-12-10箱式電阻爐(上海纖檢儀器有限公司)。

1.2 篩選方法

1.2.1 樣品采集 從構(gòu)樹根際土壤、青貯池、腐敗構(gòu)樹莖葉土壤、其他腐敗樹葉土壤等自然環(huán)境采集樣品作為分離源進(jìn)行細(xì)菌富集培養(yǎng)。

1.2.2 菌種篩選 將采集的樣品用無菌水清洗后進(jìn)行梯度稀釋，制成10-1～10-5的不同濃度，選取10-1、10-3、10-53個(gè)濃度的樣品，分別均勻涂布在蛋白酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基、纖維素酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基、單寧濃度耐受培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)48h，挑選單菌落，斜面4℃保藏菌種。

1.2.3 菌種的純化 對(duì)分離菌株進(jìn)行單菌落劃線培養(yǎng)48h，選取透明圈較大的單個(gè)菌落，再進(jìn)行劃線培養(yǎng)，重復(fù)4～5次，以此提高菌落純度。

1.2.4 菌種的復(fù)篩 選將篩選的菌種和酵母菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌接種到營養(yǎng)肉湯中，制備種子液，準(zhǔn)備復(fù)篩選。將培養(yǎng)的種子液菌種按照0.5%的量均勻加入到粉碎好的構(gòu)樹莖葉中，在培養(yǎng)箱中37℃，發(fā)酵5d。將發(fā)酵好的構(gòu)樹用烘箱105℃烘干15min，再用60℃繼續(xù)烘烤，直至構(gòu)樹烘干。然后用儀器測(cè)定處理好樣品中粗纖維含量、粗蛋白含量、單寧酶活力來判斷其發(fā)酵效果，進(jìn)行菌種篩選。

1.2.5 粗纖維、粗蛋白測(cè)定 粗纖維測(cè)定(GB64 34-94)、粗蛋白的測(cè)定(凱氏定氮法GB6432-94)、單寧酶活力測(cè)定：以沒食子酸丙酯作為單寧酶的底物，根據(jù)沒食子酸丙酯吸光值的變化，計(jì)算出單寧酶的活力。酶活力的定義：40℃反應(yīng)條件下，100μl酶液每分鐘使沒食子酸丙酯溶液在270nm處減少0.01個(gè)吸光度值定義為1個(gè)酶活力單位。酶活力計(jì)算公式：酶活力(U/ml)=[OD270nm(測(cè)定管)-OD270nm(對(duì)照管)]×稀釋倍數(shù)/0.01。

1.3 篩選菌種的鑒定

1.3.1 菌株培養(yǎng)pH值的確定 將篩選的菌株接種到不同pH值的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察菌株的生長情況。

1.3.2 菌株培養(yǎng)生長溫度的確定 將篩選的菌株接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，分別于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃條件下恒溫培養(yǎng)24h。

1.3.3 菌株厭氧性測(cè)定 將篩選的菌株穿刺接種于厭氧培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)7d，觀察記錄生長情況，如果只在表面生長者即為好氧菌，若沿穿刺線生長者則為兼性厭氧菌，若沿穿刺線下部生長者為厭氧菌。

1.3.4 菌種基因鑒定 對(duì)篩選菌株用核酸提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取；選用細(xì)菌16Sr DNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11,12]；電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用純化試劑盒進(jìn)行對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化提??；用pGEM-T載體試劑盒進(jìn)行連接；然后對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)；對(duì)鑒定的陽性克隆重組質(zhì)粒送基因測(cè)序公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離

比較篩選培養(yǎng)基篩選出來的菌種其菌落大小以及水解圈大小，最終獲得兩株較優(yōu)的蛋白酶產(chǎn)生菌，命名為D1、D2；兩株纖維素酶產(chǎn)生菌命名為X1、X2；兩株單寧酶產(chǎn)生菌為N1、N2。

2.2 菌種的復(fù)篩選

表1 菌種復(fù)篩選的結(jié)果 (%)

表2 單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同單寧濃度對(duì)2株細(xì)菌酶活力的影響 (U/ml)

從表1得出D1、D2發(fā)酵效果最好，其蛋白含量高達(dá)24.11±0.21、24.85±0.11，X1、X2的粗纖維含量最低，對(duì)粗纖維降解能力最強(qiáng)，采用SPSS軟件對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，表 1構(gòu)樹葉組與其它組存在顯著差異(P＜0.05)，這說明通過發(fā)酵的構(gòu)樹葉粗蛋白含量組明顯高于于未發(fā)酵的構(gòu)樹葉組，粗纖維含量明顯低于未發(fā)酵組。

由表2可知，N1菌株在1%組的單寧酶活力最大，均顯著高于0.5%與1.5%組(P＜0.05)，0.5%組與1.5%組相比差異顯著(P＜0.05)；N2菌株在1%組的單寧酶活力最大，通過0.5%組與1.5%組相比差異顯著(P＜0.05)，0.5%組與1.5%組相比差異不顯著(P＞0.05)。以上分析表明，單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基1%的單寧濃度對(duì)于N1、N2菌株單寧酶的產(chǎn)生具有很好的誘導(dǎo)作用，而0.5%和1.5%濃度組誘導(dǎo)作用略差，原因可能是濃度太小對(duì)菌株的刺激作用太小，而濃度太大就會(huì)對(duì)菌株繁殖及單寧酶的產(chǎn)生起到消極作用。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌株生長 pH值的確定觀察結(jié)果顯示D1、D2、X1、X2菌pH值6.0～8.0的平板上生長良好，N1、N2在pH值5.0～7.0的平板上生長較好。

2.3.2 菌株生長溫度的確定 經(jīng)培養(yǎng)后觀察到各篩選菌種均能在25～50℃的環(huán)境下生長，但是在25℃、50℃兩個(gè)溫度培養(yǎng)時(shí)明顯比較其他溫度生長明顯緩慢。在30～45℃的培養(yǎng)環(huán)境下，菌種均能顯著生長，但在40℃以上培養(yǎng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)菌種老化的速度逐漸加快，所以篩選菌株的最適的生長溫度為30～35℃左右。

2.3.3 對(duì)氧氣的需求 經(jīng)過營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)各篩選菌株在穿刺管中各處均有生長，由此證明這6種菌株都屬兼性厭氧菌。

2.3.4 16Sr DNA基因組序列測(cè)序結(jié)果 將測(cè)序所得序列和GenBank的序列進(jìn)行Blast序列同源性比對(duì)，D1該菌屬于腸桿菌目，腸桿菌科，普羅威登斯菌屬，屬于產(chǎn)堿普羅威登斯菌；D2菌株屬于伯克氏菌目，屬于克斯特菌；X1、X2鑒定結(jié)果顯示其親緣關(guān)系與芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌、蘚樣芽孢桿菌、未定種名的菌株最為接近，為芽孢桿菌屬成員。N1、N2均屬于假單胞菌菌科，經(jīng)進(jìn)一步分析得知屬于銅綠假單胞菌。

3 結(jié)論

構(gòu)樹是一種營養(yǎng)豐富的木本飼料，含有較高的粗蛋白、粗灰分、粗脂肪、磷，粗纖維含量適宜[5,6]，可以緩解我國蛋白質(zhì)飼料匱乏、緩解蛋白質(zhì)飼料對(duì)外依存的壓力。但構(gòu)樹中單寧、木質(zhì)素等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較高[7-9]，對(duì)畜禽養(yǎng)殖來說飼料適口性較差，會(huì)影響畜禽采食量。本試驗(yàn)通過培養(yǎng)基篩選出產(chǎn)蛋白酶菌、產(chǎn)纖維素酶菌、和產(chǎn)單寧酶菌，可明顯提高構(gòu)樹中蛋白質(zhì)含量，降低纖維素含量和單寧含量，為構(gòu)樹飼料進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。