方德寶，黃大可，江 飛，余宏鑄,4

膽囊癌是膽道系統(tǒng)惡性腫瘤中較常見(jiàn)、最具侵襲性的一種[1]。在中國(guó)，膽囊癌發(fā)病率約占新發(fā)腫瘤病例的1.37%,其發(fā)病率高達(dá)3.82/100 000[2]。因?yàn)闊o(wú)特異性的癥狀、診斷發(fā)現(xiàn)遲、缺乏有效的治療方式和預(yù)后指標(biāo)，膽囊癌的預(yù)后不盡如人意。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示膽囊癌的總體生存期約為6個(gè)月，5年生存率低于10%[3]。因此，研究膽囊癌的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論和臨床意義。La-related蛋白1(La-related pretein 1,LARP1)是一種RNA結(jié)合蛋白。LARP1是5′TOP mRNA翻譯的關(guān)鍵調(diào)控因子[4]，并在細(xì)胞內(nèi)mTOR活性的響應(yīng)中作為磷酸化感應(yīng)分子開(kāi)關(guān)調(diào)控核糖體mRNA翻譯和核糖體生物效應(yīng)[5]。它通過(guò)腫瘤信號(hào)通路中mTOR等基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與了腫瘤的進(jìn)展[6-7]。但目前LARP1在膽囊癌中的表達(dá)情況及其臨床價(jià)值尚不明確，現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)LARP1在非疾病膽囊、膽囊腺瘤和膽囊癌組織中的表達(dá)水平；統(tǒng)計(jì)分析3組組織標(biāo)本中LARP1的表達(dá)差異以及LARP1表達(dá)水平與膽囊癌患者臨床病理資料和預(yù)后的關(guān)系，探討LARP1在膽囊癌疾病發(fā)展中的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2011年1月～ 2016年11月經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科確診的膽囊癌組織標(biāo)本76例，膽囊腺瘤組織標(biāo)本21例，肝血管瘤聯(lián)合膽囊切除的非疾病膽囊組織標(biāo)本27例。采用切片機(jī)以4 μm厚度進(jìn)行連續(xù)切片制成組織切片，所得的組織切片均經(jīng)過(guò)病理科醫(yī)師診斷。電話隨訪膽囊癌病例至2018年11月，獲得完整隨訪52例，隨訪1～24個(gè)月。76例膽囊癌患者中，男24例，女52例；年齡36～88(63.91±11.94)歲；G1-G2(高-中分化)者51例，G3-G4(差-未分化)者25例；腫瘤TNM分期：0-Ⅰ期20例，Ⅱ-ⅢB期56例。腫瘤的TNM分期和組織分級(jí)依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer, AJCC)膽囊癌分期[8]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 試劑LARP1多克隆一抗購(gòu)自英國(guó)abcam公司；鼠抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；檸檬酸抗原修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶阻斷劑、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑盒、蘇木精染色液、中性樹(shù)膠購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 研究方法免疫組化(streptAvidin-biotincomplex,SABC)法測(cè)定每組組織標(biāo)本LARP1的表達(dá)水平，并以細(xì)胞胞質(zhì)中有明顯黃色/棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性細(xì)胞。在Nikon Eclipse 8ic顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍不連續(xù)視野，用Nikon Digital camera攝像并保存待測(cè)量圖片，Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量所得圖片中LARP1染色的平均光密度(optical density, OD)值，取平均OD值作為測(cè)量值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以M(P25,P75)表示，多組間采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)分析，兩組間差異采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析。分類(lèi)資料采用卡方檢驗(yàn)分析。應(yīng)用Kaplan-Meier法計(jì)算累積生存率，生存率差異比較采用Log-rank檢驗(yàn)。應(yīng)用Cox回歸進(jìn)行單因素及多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LARP1在非疾病膽囊組、膽囊腺瘤組和膽囊癌組中的表達(dá)LARP1在非疾病膽囊組、膽囊腺瘤組和膽囊癌組中表達(dá)的平均OD值呈進(jìn)行性增高，3組間比較和各兩組間比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1、表1)。非疾病膽囊或膽囊腺瘤與膽囊癌組間的年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 LARP1的表達(dá)水平隨膽囊癌疾病進(jìn)展逐漸增高LARP1蛋白在T2-T4期膽囊癌原發(fā)灶中的表達(dá)水平明顯高于Tis-T1期，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.177,P=0.029)；在進(jìn)展期膽囊癌亞組(TNM Ⅱ-ⅢB期)中表達(dá)水平明顯高于早期膽囊癌亞組(TNM 0-Ⅰ期)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.361,P=0.018)。另外，LARP1在G3-G4(差-未分化)亞組的表達(dá)水平高于G1-G2(高-中分化)亞組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-2.849,P=0.004),見(jiàn)表2。

2.3 LARP1與膽囊癌預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier analysis 提示的膽囊癌LARP1高表達(dá)亞組(OD值≥0.294)的術(shù)后生存期低于低表達(dá)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log Rank=7.132,P=0.008)，LARP1高表達(dá)亞組的術(shù)后中位生存期為5個(gè)月，而LARP1低表達(dá)亞組的術(shù)后中位生存期為18個(gè)月(圖2)；膽囊癌亞組TNM Ⅱ-ⅢB期的術(shù)后生存期明顯短于膽囊癌亞組TNM 0-Ⅰ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log Rank=18.972,P<0.001)(圖3)。Cox proportional hazard regression model單因素分析提示LARP1表達(dá)上調(diào)、原發(fā)灶(T)分期、TNM分期和組織學(xué)分級(jí)是膽囊癌術(shù)后之預(yù)后的危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步的多因素分析表明LARP1表達(dá)上調(diào)、TNM分期和組織學(xué)分級(jí)是影響膽囊癌預(yù)后的獨(dú)立因素(表3)。

與膽囊腺瘤組比較:*P<0.05;與膽囊癌組比較:#P<0.05; 與膽囊癌組比較：**P<0.05;與膽囊癌組比較:##P<0.05;與膽囊癌組比較:△P<0.05

表2 膽囊癌各臨床病理亞組中LARP1的表達(dá)情況

變量nLARP1表達(dá)的平均OD值M(P25,P75)ZP年齡(歲)[4]-0.7220.470 <60490.296(0.209,0.368) ≥60270.291(0.215,0.359)性別-1.2890.197 男240.280(0.209,0.379) 女520.267(0.208,0.335)原發(fā)灶(T)[4]-2.1770.029 Tis-T1220.227(0.191,0.336) T2-T4540.309(0.250,0.388)區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)(N)[4]-0.4080.683 N0520.275(0.207,0.384) N1240.303(0.232,0.361)TNM分期[4]-2.3610.018 0-Ⅰ200.226(0.330,0.165) Ⅱ-ⅢB560.309(0.250,0.385)組織學(xué)分級(jí)[4]-2.8490.004 G1-G2(高-中分化)510.270(0.201,0.335) G3-G4(差-未分化)250.336(0.266,0.427)

表3 單因素及多因素Cox回歸模型分析影響術(shù)后生存時(shí)間的因素

3 討論

闡述膽囊癌發(fā)生的膽囊腺瘤-膽囊癌假說(shuō)在形態(tài)學(xué)[9]和DNA測(cè)序研究[10]中都得到了驗(yàn)證。近期的研究[11]提示：在年輕韓國(guó)膽囊癌患者的腫瘤形成中，膽囊腺瘤-膽囊癌假說(shuō)較化生-異常增生-膽囊癌假說(shuō)扮演著更為重要的角色。本實(shí)驗(yàn)基于正常膽囊-膽囊腺瘤-膽囊癌假說(shuō)，利用免疫組化的方法檢測(cè)了手術(shù)病理確診的非疾病膽囊、膽囊腺瘤和膽囊癌3組石蠟標(biāo)本組織中LARP1的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)分析了3組LARP1表達(dá)水平的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LARP1在非疾病膽囊組、膽囊腺瘤組和膽囊癌組中的表達(dá)水平呈進(jìn)行性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示LARP1可能參與了膽囊癌的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中膽囊癌組與非疾病膽囊組或膽囊腺瘤組組間的年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示年齡可能是1個(gè)膽囊癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素。1份近期的大樣本統(tǒng)計(jì)也提示膽囊癌的發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)而增高，其中40.5%的患者年齡≥75歲[12]。

圖2 膽囊癌不同LARP1表達(dá)水平亞組的術(shù)后生存曲線

圖3 膽囊癌不同TNM分期亞組的術(shù)后生存曲線

T分期[13-14]和組織學(xué)分級(jí)[15]是膽囊癌的兩個(gè)重要預(yù)后因素，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同TNM分期和組織學(xué)分級(jí)亞組的膽囊癌組織中LARP1表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LARP1在膽囊癌亞組TNM Ⅱ-ⅢB期中表達(dá)水平明顯高于膽囊癌亞組TNM 0-Ⅰ期(Z=-2.361,P=0.018)；同樣在G3-G4亞組中的表達(dá)水平高于G1-G2亞組(Z=-2.849,P=0.004)。這提示LARP1可能參與了膽囊癌的進(jìn)展。對(duì)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的研究發(fā)現(xiàn)：與正常對(duì)照細(xì)胞相比，NSCLC細(xì)胞中LARP1的m-RNA水平增加；敲除LARP1可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；而且非小細(xì)胞肺癌組織中LARP1的過(guò)表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和不良生存相關(guān)。

在直腸癌[16]中，LARP1表達(dá)升高與腫瘤的TNM分期和分化程度相關(guān)，敲除LARP1可抑制CRC細(xì)胞的增殖；多因素分析提示LARP1是影響直腸癌總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。為了解LARP1表達(dá)水平與膽囊癌患者術(shù)后生存時(shí)間之間的關(guān)系，課題組根據(jù)LARP1表達(dá)水平的不同將患者分為高表達(dá)亞組和低表達(dá)亞組，并以此制作了Kaplan-Meier生存曲線。結(jié)果表明LARP1表達(dá)越高的患者術(shù)后生存時(shí)間越短，而且2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log Rank=7.132,P=0.008)。進(jìn)一步的單因素和多變量COX回歸統(tǒng)計(jì)分析顯示LARP1、TNM分期和組織學(xué)分級(jí)是影響膽囊癌術(shù)后之生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，LARP1作為一種潛在的生物標(biāo)志物，為膽囊癌的診斷和預(yù)后分析提供了新的手段，為膽囊癌的治療提供了新的見(jiàn)解和研究思路，但如何有效調(diào)控LARP1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的具體機(jī)制，尚需要進(jìn)一步的探索。