陳 碩，杜 鵑

動脈粥樣硬化可誘發(fā)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死等心血管疾病[1]，其病理機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未完全明確。近年有研究表明氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, OxLDL)在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中，尤其是其內(nèi)皮損傷方面起著重要的作用[2]。有研究[2]報道OxLDL可引起多種血管內(nèi)皮損傷，造成其功能破壞，甚至發(fā)生血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

血管內(nèi)皮介導(dǎo)的舒張反應(yīng)是血管的重要功能之一，參與器官血流供應(yīng)的調(diào)節(jié)，對器官的功能，尤其在缺血性損傷時發(fā)揮重要的影響，直接關(guān)系到缺血性損傷疾病的發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸。但目前尚未見有文獻(xiàn)報道OxLDL對血管內(nèi)皮介導(dǎo)的舒張功能的影響。該研究擬觀察OxLDL對大鼠冠狀動脈和腸系膜動脈的內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響，并初步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1藥品與試劑 OxLDL購自中國廣州奕元生物技術(shù)有限公司；乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)、U46619、Fura-2Am及毒胡蘿卜素(thapsigargin, TG)購自美國Sigma公司；胰蛋白酶、胎牛血清及1640培養(yǎng)基購自中國臺灣BI公司；一氧化氮(nitric oxide, NO)和硫化氫(H2S)檢測試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.1.2實驗動物及細(xì)胞株 SD大鼠，雄性，180 ～ 220 g；合格證號：SCXK(皖)2017-001，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度在(22±2) ℃，通風(fēng)良好，可自由攝水進(jìn)食；人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human coronary artery endothelial cells, HCAECs)，購自上海晶都有限公司公司。

1.2 實驗方法

1.2.1血管張力實驗[3]采用10%水合氯醛300 mg/kg麻醉SD大鼠，迅速打開胸腔和腹腔，取出心臟和腸系膜動脈(mesenteric artery, MA)，放入通入95% O2+5%CO2的冰浴PSS液中。將心臟的尖端和右心房固定于平皿中，去除心外膜，從主動脈根部和動脈圓錐間淺表處的冠狀動脈(coronary artery, CA)主干暴露并分離CA。將分離的大鼠CA和MA制成約2 ～ 3 mm長的血管環(huán)。

將大鼠血管環(huán)置入盛有5 ml 95% O2+5% CO2飽和的生理鹽溶液[physiological salt solution,PSS；成分(mmol/L):NaCl 119、KCl 4.7、NaHCO324、KH2PO41.18、MgSO41.17、EDTA 0.026、CaCl21.6、glucose 5.5，pH 7.4]的DMT四通道血管張力測定儀的浴槽中。將一直徑20 μm鋼絲的頭端順時針固定于張力傳感器上。調(diào)節(jié)顯微鏡放大倍數(shù)至能清晰看見鋼絲尾端為宜，用顯微鑷夾住血管環(huán)一端緩慢通過鋼絲正中并固定。再將另一根鋼絲緩慢穿過血管環(huán)的管腔中，并固定于右側(cè)傳感器上。浴槽溫度維持在37 ℃，并持續(xù)通入95% O2+5% CO2混合氣體。血管張力采用ML785 PowerLab/4sp記錄和分析系統(tǒng)測定。

血管在零張力狀態(tài)下平衡60 min后，調(diào)整血管初始張力為1 mN。再平衡30 min，用30 mmol/L KCl收縮血管后，用PSS洗脫KCl，連續(xù)兩次。若前后兩次收縮幅度差異小于10%，表示血管環(huán)收縮活性良好。加入PSS或100 mg/L OxLDL預(yù)處理30 min后，用100 nmol/L U46619收縮血管，待收縮穩(wěn)定后，加入累積濃度的ACh, 觀察血管的舒反應(yīng)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)[4]將HCAEC細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，并置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 ～ 3 d換液1次，4 d左右傳代。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞開始實驗。

1.2.3NO[5]和H2S[6]將上述培養(yǎng)的HCAEC細(xì)胞移入96孔培養(yǎng)板中(1×106/ml, 100 μl/孔)，置37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)穩(wěn)定12 h后，在其中5個孔的細(xì)胞中加入終濃度為100 μg/ml的OxLDL為實驗組，在另外5個孔的細(xì)胞中加入PSS為對照組。各組細(xì)胞繼續(xù)在37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移入EP管中，3 000 r/min離心10 min。分別按照NO和H2S檢測試劑盒說明書提供的操作方法，在550 nm和670 nm 處測定離心的上清液中NO和H2S的吸光度(OD)。

1.2.4鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry, SOCE)的測定[7 - 8]將上述離心沉淀的HCAEC細(xì)胞重新懸浮后，加入終濃度為5 μmol/L的Fura-2Am在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min后接種于多聚賴氨酸包被的玻片上。玻片用無鈣PSS溶液(mM:NaCl 140、MgCl21.0、KCl 5.0、EGTA 0.2、glucose 10、HEPES 4.0，pH 7.4)清洗2遍后，置含有500 μl無鈣PSS的鈣成像儀浴槽中，實時記錄細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+濃度([Ca2+]i)的熒光信號。實驗中，首先記錄靜息[Ca2+]i的熒光信號，然后加入終濃度為2 μmol/L的TG，耗竭性促進(jìn)鈣池釋放Ca2+，最后加入終濃度為1 mmol/L Ca2+引起鈣池操縱性鈣通道( store-operated calcium channel, SOCC)介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流(即SOCE)，連續(xù)記錄20 min。[Ca2+]i由鈣熒光信號強(qiáng)度來表示，鈣池釋放Ca2+量和SOCE分別由加入TG時最高熒光信號強(qiáng)度與靜息熒光信號強(qiáng)度之差和加入1 mmol/L Ca2+時最高熒光信號強(qiáng)度與靜息信號熒光強(qiáng)度之差來表示。

2 結(jié)果

2.1 OxLDL對大鼠血管內(nèi)皮舒張功能的影響結(jié)果如圖1所示，ACh在1×10-9～1×10-5mol/L范圍內(nèi)可顯著地引起大鼠腸系膜動脈和冠狀動脈的舒張(P<0.01)。與在大鼠腸系膜動脈上的作用一樣，100 mg/L OxLDL預(yù)處理可明顯減弱ACh誘導(dǎo)的冠狀動脈舒張作用(P<0.01)。鑒于ACh誘導(dǎo)的血管舒張作用為內(nèi)皮依賴性的，該結(jié)果提示OxLDL預(yù)處理可減弱大鼠冠狀動脈的內(nèi)皮舒張依賴的舒張功能。

2.2 OxLDL對HCAEC細(xì)胞中NO和H2S含量的影響結(jié)果如圖2A所示，與對照組相比，當(dāng)HCAEC細(xì)胞與100 μg/mL OxLDL孵育24 h時，培養(yǎng)上清液中NO含量沒有明顯的差異，提示OxLDL對HCAEC細(xì)胞中NO生成未見明顯的影響；圖2B表明 100 μg/ml OxLDL可顯著地降低HCAEC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中H2S濃度(P<0.01)，提示OxLDL可抑制內(nèi)皮細(xì)胞中H2S的生成。

圖1 OxLDL對ACh誘導(dǎo)的大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響A:腸系膜動脈；B:冠狀動脈；與PPS+PPS組比較:**P<0.01；與OxLDL+PPS組比較:##P<0.01；與PPS+ACh組比較:▽▽P<0.01

圖2 OxLDL對HCAECs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO和H2S含量的影響A:NO含量；B:H2S含量；與Control組比較:**P<0.01

2.3 OxLDL對HCAEC細(xì)胞SOCE的影響結(jié)果如圖3A所示，100 μg/ml OxLDL孵育24 h雖可使HCAEC細(xì)胞中靜息[Ca2+]i有增加的趨勢，但與對照組比較無明顯的差異；OxLDL可明顯地減少TG誘導(dǎo)的鈣庫釋放Ca2+(P<0.05)，并進(jìn)而抑制其誘導(dǎo)的SOCE (P<0.05)，該結(jié)果表明OxLDL對TG誘導(dǎo)的鈣庫釋放Ca2+和及其誘導(dǎo)的SOCE有明顯的抑制作用。

3 討論

眾所周知ACh誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)為內(nèi)皮依賴性。在去除內(nèi)皮的血管上，ACh則喪失其血管舒張作用，甚至還會誘導(dǎo)輕微的血管收縮作用[9-10]。本研究觀察到在1×10-9～1×10-5mol/L范圍內(nèi)，ACh可顯著地舒張U46619預(yù)收縮的大鼠CA和MA，而100 mg/L OxLDL預(yù)處理可明顯減弱ACh對大鼠CA和MA的舒張作用，表明OxLDL預(yù)處理對大鼠血管內(nèi)皮介導(dǎo)的血管舒張功能有一定的損傷作用。

ACh誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)是通過促進(jìn)血管內(nèi)皮合成和釋放內(nèi)皮衍生舒張因子而產(chǎn)生的。H2S作為一種新型的氣體信號分子和內(nèi)皮源性血管舒張因子受到了越來越多的關(guān)注。內(nèi)皮源性H2S可由胱硫醚-γ-裂解酶催化半胱氨酸(l-cysteine)或3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶聯(lián)合半胱氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化3-巰基丙酮酸生成的。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過這些酶促反應(yīng)可產(chǎn)生足夠量的H2S來舒張平滑肌細(xì)胞，降低血管的張力[11]。內(nèi)皮源性H2S誘導(dǎo)的舒張作用與激活平滑肌細(xì)胞上的鈣激活鉀(KCa)通道有關(guān)[6, 12]。NO也是血管內(nèi)皮生成的一種主要的舒張因子之一。為探討OxLDL損傷血管內(nèi)皮舒張功能的機(jī)制，本研究在體外培養(yǎng)了人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAECs細(xì)胞株)，觀察OxLDL對HCAEC細(xì)胞中NO和H2S生成的影響。結(jié)果表明OxLDL對HCAEC細(xì)胞中NO生成無明顯影響，但可顯著地降低H2S的生成，提示抑制H2S的生成可能是OxLDL損傷血管內(nèi)皮舒張功能的機(jī)制之一。

當(dāng)細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等鈣池中Ca2+減少到一定的程度，為補(bǔ)充鈣池中Ca2+，可誘導(dǎo)鈣庫操縱的鈣離子通道(store-operated calcium channel, SOCC)的激活，導(dǎo)致細(xì)胞外的Ca2+內(nèi)流，即SOCE的發(fā)生。SOCE廣泛存在于興奮細(xì)胞和非興奮細(xì)胞中，尤其在內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等非興奮細(xì)胞中是Ca2+內(nèi)流產(chǎn)生的主要方式，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)可通過增殖和遷移對受損血管進(jìn)行修復(fù)。有研究表明上調(diào)SOCE可增加[Ca2+]i，進(jìn)而促進(jìn)EPCs的增殖和遷移，對血管產(chǎn)生保護(hù)作用[13]。因此，SOCE可能是血管損傷的一個新的治療靶點。

TRP4通道是內(nèi)皮細(xì)胞中SOCC中不可缺少的組成部分。在TRP4-/-小鼠上，由于TRP4通道的敲除導(dǎo)致了SOCE的缺失，顯著地減弱了ACh的血管內(nèi)皮依賴性的舒張作用[14]。在豚鼠主動脈上，Ca2+載體A23187可通過一種未知的機(jī)制耗盡儲存的Ca2+，激活SOCC，導(dǎo)致SOCE的發(fā)生，可產(chǎn)生內(nèi)皮依賴性的血管舒張反應(yīng)[15]。這些研究資料表明內(nèi)皮細(xì)胞SOCE與血管內(nèi)皮舒張功能密切相關(guān)，SOCE的缺失或減弱可損害血管內(nèi)皮依賴性的舒張功能。本研究結(jié)果表明OxLDL可明顯地減弱TG誘導(dǎo)HCAEC細(xì)胞鈣庫釋放Ca2+，并進(jìn)而抑制SOCE的發(fā)生，這與其減弱ACh誘導(dǎo)的大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)是一致的，提示減弱內(nèi)皮細(xì)胞SOCE可能也是OxLDL損傷血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的機(jī)制之一，至于詳細(xì)機(jī)制有待于今后的進(jìn)一步研究。

圖3 OxLDL對HCAEC細(xì)胞的鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(SOCE)的影響A:靜息胞質(zhì)鈣濃度；B:鈣庫釋放的鈣；C:SOCE；與Control組比較：*P<0.05,**P<0.01