周 宏，李名聰，顧亞男，朱婷婷，羅 欣，張勝權(quán)

皮膚覆蓋于人體表面，是人體最大的器官之一。皮膚由表皮和真皮兩部分組成，其中表皮的關(guān)鍵功能是在生物體和外界之間形成屏障，對人體有重要的保護(hù)作用。皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes, KCs)是表皮的主要組成部分[1]。甲羥戊酸途徑是細(xì)胞重要的代謝途徑，其通過合成甾醇類異戊二烯(如：膽固醇)和非甾醇類異戊二烯在多種細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用[2]。甲羥戊酸途徑的中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物包括：甲羥戊酸(mevalonic,MVA)、法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)、香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)、膽固醇(cholesterol,CH)等[3]。膽固醇是細(xì)胞膜系統(tǒng)的組成成份，在體內(nèi)可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成重要的生理活性物質(zhì),如膽汁酸、類固醇激素及維生素D(vitaminD，VitD)[4]。FPP和GGPP可以提供異戊烯基給小G蛋白的脂化過程，通過活化蛋白來影響細(xì)胞代謝途徑[5]。研究[6-7]表明法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 (farnesyltransferase inhibitor,FTI)-277和香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(geranylgeranyl transferase inhibitor,GGTI)-298的組合模擬了他汀類介導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白酶(extracellular regulated protein kinases5,ERK5)激活內(nèi)皮保護(hù)機(jī)制。香葉基香葉醇能夠阻斷細(xì)胞凋亡，香葉基香葉基化參與了蛋白質(zhì)的凋亡途徑[8-9]?，F(xiàn)使用FTI-277和GGTI-298作用于KCs，初步探討其對KCs增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)試劑從外科手術(shù)獲得的皮膚中分離出KCs；M154CF 培養(yǎng)基、Coating Matrix基質(zhì)、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和neutral protease(中性蛋白酶)(美國Gibco公司)；青霉素鏈霉素溶液、RIPA裂解液和細(xì)胞周期試劑盒(上海碧云天生物公司)；MTS試劑盒及抑制劑FTI和GGTI(美國sigma公司)；CyclinB1、CyclinE及β-actin(美國abcam公司)；P21、p-AKT、p-ERK1/2(美國Santa Cruz公司)；所有使用的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 在無菌條件下，用70%乙醇漂洗手術(shù)中取得的患者包皮組織。在無血清的培養(yǎng)基清洗數(shù)次以去除表面細(xì)菌。用已高溫滅菌的鑷子和剪刀將皮膚組織剪成多個(gè)小塊，反復(fù)用無血清的培養(yǎng)基沖洗數(shù)次，轉(zhuǎn)移至中性蛋白酶中，4 ℃消化過夜。第2天取出充分消化的皮膚組織剝離表皮層，加入0.025%胰蛋白酶消化5 min。然后用無菌注射器鈍頭在200目細(xì)胞篩上研磨，用無菌無血清的培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，將所得液體離心，用M154培養(yǎng)基緩慢吹打形成KCs懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種，37 ℃、5% CO2恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞活力測定實(shí)驗(yàn)(MTS) 在96孔板中預(yù)先鋪上Coating Matrix，再接種KCs細(xì)胞(0.025%胰酶消化收集)，每孔100 μl(6×104/ml)，均勻鋪板，直到細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，分別加入藥物FTI(使終濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μmol/L)、GGTI(使終濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μmol/L)，同時(shí)設(shè)置對照組(0 μmol/L)。2 d后，每孔加20 μl MTS試劑混勻，37 ℃、5% CO2孵育3～4 h后，酶標(biāo)儀檢測在490 nm處的吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3細(xì)胞周期檢測 在6孔板中預(yù)先鋪上Coating Matrix，再接種KCs細(xì)胞(0.025%胰酶消化收集)，密度為5×104/ml，孵箱中孵育，直到細(xì)胞密度達(dá)到70%～ 80%，分別加入藥物：FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)，并設(shè)置對照組(0 μmol/L)。2 d后，收集KCs(0.025%胰酶消化)，室溫下，按照細(xì)胞周期試劑盒的說明書操作，避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，F(xiàn)lowjo軟件分析細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測蛋白P21、CyclinB1和CyclinE的表達(dá) 在24孔板(2×105/孔)中預(yù)先鋪上Coating Matrix，再接種KCs細(xì)胞(0.025%胰酶消化收集)，直到細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，分別加藥：FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)，并設(shè)置對照組(0 μmol/L)。2 d后，收集KCs細(xì)胞(0.025%胰酶消化)，從細(xì)胞中提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，配制適當(dāng)濃度的膠，每孔加入10 μl上樣，然后電泳，恒壓60 V電泳45 min，加壓到120 V恒壓電泳1 h，轉(zhuǎn)膜(恒流300 mA，1.5 h)，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗(CyclinB1、CyclinE及β-actin濃度1 ∶1 000，P21、p-AKT、p-ERK1/2濃度1 ∶500)孵育2 h，洗膜，常溫?fù)u床孵育二抗(濃度1 ∶10 000)2 h，用Thermo Super Signal West Trial Kit化學(xué)發(fā)光底物顯影，分析目的蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 FTI和GGTI能抑制KCs增殖隨著FTI、GGTI藥物濃度的增加，細(xì)胞活力呈下降趨勢，當(dāng)FTI藥液濃度為5 μmol/L、GGTI藥液濃度為5 μmol/L時(shí)KCs細(xì)胞相對活力最小，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1A。KCs細(xì)胞分別被FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)單獨(dú)處理時(shí)，F(xiàn)TI處理組的KCs細(xì)胞活力為85.3%，GGTI處理組的KCs細(xì)胞活力為75.5%，F(xiàn)TI和GGTI均能抑制KCs細(xì)胞增殖，抑制率分別為14.7%、24.5%(F=305.418，P<0.01)，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1B。

圖1 FTI和GGTI單獨(dú)處理對KCs增殖抑制作用A：不同濃度的FTI、GGTI單獨(dú)作用KCs細(xì)胞2 d后對細(xì)胞增殖的影響；B：FTI(5.0 μmol/L)、GGTI(5.0 μmol/L)單獨(dú)處理KCs后對其增殖影響；與空白對照組比較：**P<0.01

2.2 FTI和GGTI對KCs細(xì)胞周期G1期的阻滯效應(yīng)不明顯FTI、GGTI單獨(dú)處理KCs細(xì)胞時(shí)，對細(xì)胞G1期阻滯作用均不明顯。見圖2。

2.3 GGTI、FTI單獨(dú)處理KCs對細(xì)胞周期蛋白CyclinB1、CyclinE和P21表達(dá)的影響GGTI單獨(dú)處理KCs后，與空白對照組相比，GGTI加藥組CyclinB1表達(dá)下調(diào)(F=358.748，P<0.01)，CyclinE的表達(dá)上調(diào)(F=16.684，P<0.05)；同時(shí)FTI單獨(dú)加藥組CyclinB1表達(dá)下調(diào)(F=15.065，P<0.05)，CyclinE的表達(dá)上調(diào)(F=78.880,P<0.01)；GGTI、FTI單獨(dú)加藥組均能上調(diào)P21的表達(dá)(F=348.004，P<0.01)，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3A、B。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

圖3 FTI和GGTI單獨(dú)用藥對KCs細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響A：各加藥組對KCs細(xì)胞周期蛋白的影響；B：各加藥組蛋白表達(dá)的灰度分析；a:空白對照組;b:GGTI加藥組;c:FTI加藥組；與空白對照組相比較：*P<0.05,**P<0.01

2.4 FTI、GGTI單獨(dú)處理KCs對PERK1/2、PAKT表達(dá)的影響FTI、GGTI分別單獨(dú)處理KCs后，PERK1/2的表達(dá)下調(diào)(F=89.980，P<0.01)，pAKT的表達(dá)上調(diào)(F=37.709，P<0.01)，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4A、B。

3 討論

皮膚的屏障結(jié)構(gòu)和功能對人體健康至關(guān)重要。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的功能表明，皮膚在使全身生理適應(yīng)不斷變化的環(huán)境中起著重要作用[10]。甲羥戊酸途徑對細(xì)胞影響重大，是細(xì)胞最重要的代謝途徑之一[11]。甲羥戊酸激酶對KCs的增殖、分化、凋亡及相關(guān)信號途徑有重要的影響[12]。

圖4 FTI和GGTI單獨(dú)用藥對KCs信號途徑蛋白表達(dá)的影響A：各加藥組單獨(dú)處理KCs對信號途徑蛋白的影響；B：蛋白表達(dá)的灰度分析；a:空白對照組;b:GGTI加藥組;c:FTI加藥組；與空白對照組相比較：**P<0.01

本研究表明，F(xiàn)TI和GGTI對KCs的增殖有抑制作用，可能是在甲羥戊酸代謝途徑中，F(xiàn)TI對FPP、GGTI對GGPP抑制下游反應(yīng)進(jìn)行，導(dǎo)致其積累上游產(chǎn)物MVA、FPP、GGPP，缺失下游產(chǎn)物CH，上游產(chǎn)物累積和下游產(chǎn)物CH缺失都可能引起細(xì)胞代謝紊亂。P21抑制細(xì)胞周期從G1/S期[13]，CyclinE過表達(dá)會(huì)停留在G1期[14]，降低CyclinB1阻滯細(xì)胞于G2/M期[15]。FTI和GGTI降低了CyclinB1的表達(dá)，與此同時(shí)CyclinE、P21的表達(dá)得到了增強(qiáng)。此外，MAPK是接受膜受體轉(zhuǎn)換與傳遞的信號并將其帶入核內(nèi)的重要途徑，在許多細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路中具有關(guān)鍵作用。P13K-AKT參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。從而探討了MAPK和P13K-AKT兩個(gè)代謝途徑中KCs增殖的影響，分別單獨(dú)補(bǔ)充FTI、GGTI這兩種抑制劑，與空白對照組相比，均表現(xiàn)為pERK1/2下調(diào)且pAKT的上調(diào)。然而這兩種信號途徑相當(dāng)復(fù)雜，其影響的具體方式和途徑還有待討論。

所以，F(xiàn)TI和GGTI對皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖均有抑制作用。根據(jù)本研究結(jié)果，推測甲羥戊酸代謝途徑中膽固醇合成受到影響，破壞皮膚細(xì)胞正常增殖。本實(shí)驗(yàn)僅為體外細(xì)胞研究，可以此為基礎(chǔ)，構(gòu)建甲羥戊酸代謝途徑相關(guān)基因的動(dòng)物模型，通過體外和體內(nèi)兩角度來研究甲羥戊酸代謝途徑紊亂對皮膚表型的影響及其相關(guān)分子機(jī)制的研究。