李程 黎妍妍 楊小瓊 李春黎 許玉享 王林 陳守文 楊勇

摘要??將實(shí)驗(yàn)室保藏的青枯病拮抗菌ZM9和YH-22配制成復(fù)合菌劑，并將萬壽菊提取物和復(fù)合菌劑聯(lián)合配制成協(xié)同菌劑，通過分析萬壽菊提取物對(duì)青枯菌的抑制效果，復(fù)合菌劑和協(xié)同菌劑抑制青枯菌的效果。結(jié)果表明，萬壽菊提取物對(duì)青枯菌具有抑制作用，且萬壽菊提取物用量與抑制效果呈顯著負(fù)相關(guān)（Pearson=-0.997，P=0.047）;萬壽菊提取物對(duì)青枯病拮抗菌有一定的促進(jìn)作用;復(fù)合菌劑和協(xié)同菌劑對(duì)青枯菌均有抑制作用，協(xié)同菌劑抑菌效果顯著高于復(fù)合菌劑;綜合分析表明萬壽菊提取物可以與青枯病拮抗菌聯(lián)合施用，并能增強(qiáng)對(duì)青枯菌病原菌抑制效果。研究結(jié)果為煙草青枯病生防菌劑的研制拓展了新的方向。

關(guān)鍵詞??煙草青枯病;拮抗菌;萬壽菊提取;復(fù)合菌劑;協(xié)同菌劑

中圖分類號(hào)??S??435.72文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

文章編號(hào)??0517-6611（2020）04-0128-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.038

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

The Inhibitory ?Effect of ?Synergistic and Compound Antagonistic Agent on Tobacco Bacterial Wilt

LI ?Cheng1，LI ?Yan-yan2，YANG Xiao-qiong1 et al??（1.School of ?Life ?Sciences，Hubei University，Wuhan，Hubei ?430062;2.Tobacco Research Institute of Hubei Province，Wuhan，Hubei ??430030）

Abstract??In this experiment，the antagonistic bacteria of tobacco bacterial wilt ZM9 and YH-22 preserved in our laboratory were prepared into compound bacterial agent.Marigold rhizome extract and above-mentioned compound bacterial agent were combined to prepare synergistic bacterial agent.By analyzing and comparing the inhibitory effect of marigold rhizome extract，compound bacterial agent and synergistic bacterial agent on tobacco bacterial wilt， it was found that marigold rhizome extract had an inhibitory effect on the tobacco bacteria wilt，and the amount of marigold rhizome extract was negatively correlated with the inhibitory effect （Pearson=-0.997，P=0.047）.Besides，marigold rhizome extract can promote the growth of antagonistic bacteria of tobacco bacterial wilt to some extent.According to the statistical analysis of bacteriostatic circle and plate colony number，both the synergistic bacterial agent and compound bacterial agent had inhibiting effect on tobacco bacterial wilt，but the inhibitory effect of synergistic bacterial agent was significantly higher than that of compound bacterial agent.Comprehensive analysis showed that marigold rhizome extract could combine with antagonistic bacteria of tobacco bacterial wilt ZM9 and YH-22 to enhance the inhibitory effect of tobacco bacterial wilt.The resuts of this study opened a new direction for the development of tobacco bacterial wilt biocontrol agents.

Key words??Tobacco bacterial wilt;Antagonistic bacteria;Marigold rhizome extract;Compound bacteria agent;Synergistic bacteria agent

煙草青枯病對(duì)煙葉生產(chǎn)的影響備受關(guān)注[1-2]，煙草青枯病防治成為煙葉生產(chǎn)相關(guān)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一[3-5]。目前防治青枯病的策略主要包括化學(xué)防治、生物防治和農(nóng)藝防治[5]，其中化學(xué)防治存在后期防效差，長期施用導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性[6]，抗病品種選育成功率低是農(nóng)業(yè)防治中關(guān)鍵性難題[7-8]，生物防治方法因其安全無公害和長效等優(yōu)點(diǎn)成為煙草青枯病防治的熱點(diǎn)[2，7]，其中采用生物菌劑防治煙草青枯病的方式得到相關(guān)研究領(lǐng)域認(rèn)可[8]，且復(fù)合生防菌的應(yīng)用成為主流趨勢[9]。研究雖然取得了一些效果[10]，但青枯病蔓延趨勢并未得到有效的控制[11]。為控制煙草青枯病的發(fā)生和蔓延，探討和尋找新的防治方法顯得尤為重要。

植物含有許多具有殺蟲和抑菌等功效的生物活性物[12]，廣泛應(yīng)用于病害防治[13]。萬壽菊是一種多用途作物，具有抗菌性能[14] ，利用萬壽菊活性成分防治土傳病害的研究較多[15-18]。但萬壽菊活性成分中也有有益于微生物的成分 ，能否將萬壽菊與青枯菌拮抗菌復(fù)合，并應(yīng)用于煙草青枯病防治值得探討。

筆者將實(shí)驗(yàn)室所篩選的青枯病拮抗菌配制成復(fù)合菌劑，將萬壽菊提取物與拮抗菌聯(lián)合配制成增效復(fù)合菌劑，既發(fā)揮萬壽菊抑制青枯菌的特性，又利用萬壽菊提取物中有益于拮抗菌的成分。通過對(duì)比分析測試其抗菌效果，為研制新的煙草青枯病生防菌劑提供參考。

1??材料與方法

1.1??菌種來源和培養(yǎng)基

煙草青枯病病原菌（HF-1-2）、煙草青枯病拮抗菌（ZM9和YH-22）均為筆者所在課題組篩選保藏[19-20]。

LB固體培養(yǎng)基：氯化鈉 10 g，蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，1 000 ?mL水，加入1.8%瓊脂。NA液體培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，蛋白胨 5 g，牛肉膏 3 g，1 000 ?mL 水，pH 7.2～7.4，固體培養(yǎng)基加入1.8%瓊脂。TTC固體培養(yǎng)基：0.5 g紅四氮唑（TTC）溶于100 mL蒸餾水中，經(jīng)過濾滅菌后即為0.5%TTC水溶液;每100 mL NA固體培養(yǎng)基中加入0.5%TTC水溶液1 mL。

1.2??方法

1.2.1??拮抗菌相互拮抗效果分析。 采用稀釋涂平板的方法，檢測ZM9和YH-22之間的抑制作用。在LB固體平板上分別涂布ZM9和YH-22（濃度均為1.0×109CFU/mL），然后在培養(yǎng)基上打直徑5 mm的孔，分別對(duì)應(yīng)交叉加入YH-22和ZM9發(fā)酵液稀釋液100 μL（釋稀至10-7倍），37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.2??拮抗菌對(duì)青枯菌抑制效果分析。采用平板對(duì)峙法，檢測ZM9和YH-22對(duì)青枯病病原菌的抑制作用是否具有疊加效應(yīng)。在LB固體培養(yǎng)基中接種青枯病病原菌100 ?μL（1.0×109 CFU/mL），倒平板，然后在培養(yǎng)基上打5 mm孔，分別加入拮抗菌ZM9和YH-22發(fā)酵液稀液100 μL（釋稀至10-7倍），以及ZM9和YH-22發(fā)酵液稀釋液各50 μL混勻成混合液100 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.3??萬壽菊根莖提取物對(duì)青枯菌的作用分析。 將長勢良好的萬壽菊拔出，根部洗凈后50 ℃烘干，把根莖收集后磨碎過60目篩，即為萬壽菊根莖提取物。取0、5和10 g/L萬壽菊根莖提取物分別添加到NA固體培養(yǎng)基中，115 ℃滅菌20 min，滅菌后的固體培養(yǎng)基加入TTC倒平板，在平板上涂布100 ?μL（1.0×109 CFU/mL）青枯病病原菌HF-1-2發(fā)酵液稀釋液，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

1.2.4??萬壽菊根莖提取物對(duì)拮抗菌的作用分析。 取0、5和10 g/L萬壽菊根莖提取物分別添加到LB固體培養(yǎng)基中，115 ℃滅菌20 min。滅菌后的固體培養(yǎng)基倒平板后分別涂布100 ?μL ZM9和YH-22發(fā)酵液稀釋液（濃度均為1.0×109 CFU/mL）， 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱12 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

1.2.5??復(fù)合菌劑和協(xié)同菌劑對(duì)青枯菌抑制效果分析。 將ZM9和YH-22混合發(fā)酵制成的菌劑稱作復(fù)合菌劑（FH），將復(fù)合菌劑與萬壽菊根莖提取物混合制成的菌劑稱作協(xié)同菌劑（XT）。在滅菌后的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，分別加入3 ?g/L復(fù)合菌劑和協(xié)同菌劑，并接種1%的青枯病病原菌HF-1-2，以不加菌劑的為對(duì)照，37 ℃，230 r/min培養(yǎng)24 h;然后取培養(yǎng)液稀釋10-7倍，再分別取稀釋液100 μL涂布于加入TTC的NA固體平板， 37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后觀察菌體的生長情況;同時(shí)采用平板對(duì)峙法，在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中加入1%的HF-1-2菌液，倒平板，待冷卻后用打孔器打出

直徑5 mm的孔，取100 μL發(fā)酵液加入孔中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，12 h后觀察菌體的生長情況。滅菌水為對(duì)照。

2??結(jié)果與分析

2.1??拮抗菌相互拮抗效果分析??利用平板對(duì)峙法對(duì)ZM9和YH-22拮抗作用進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ZM9平板打孔加入YH-22發(fā)酵液，或者YH-22平板打孔加入ZM9發(fā)酵液，均沒有出現(xiàn)抑菌圈（圖1）。

2.2??拮抗菌對(duì)青枯菌抑制效果分析??利用平板對(duì)峙法分析不同拮抗菌對(duì)青枯菌的抑制作用，結(jié)果顯示ZM9和YH-22對(duì)青枯菌均有抑制作用，但抑制強(qiáng)度不同（圖2a、b、c）。ZM9和YH-22對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑分別為（6.87±1.54）、 （9.23±1.30） mm，ZM9和YH-22混合后對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑為（18.13±3.26）mm，ZM9和YH-22拮抗青枯菌的抑菌圈直徑差異顯著（t-test，P>0.05），而ZM9和YH-22混合對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑顯著大于ZM9和YH-22抑菌圈直徑（t-test， PZM9=0.015，PYH22=0.032）。

2.3??萬壽菊對(duì)青枯菌抑制作用分析??在0、5和10 g/L萬壽菊提取物使用量條件下，青枯菌菌落數(shù)分別為543.67±64.45、378.67±48.95和164.67±53.51（圖3a、b、c），且不同萬壽菊提取物用量間青枯菌菌落數(shù)存在顯著差異（t-test，P<0.05，圖3d）。

2.4??萬壽菊對(duì)拮抗菌的作用分析??添加0、5和10 g/L萬壽菊提取物后ZM9的菌落數(shù)分別為284.56±39.87、303.34±42.36、326.76±22.12（圖4a、b和c）;添加0、5和10 g/L萬壽菊提取物后YH-22的菌落數(shù)分別為146.24±36.98，211.29±33.33和 297.58±28.96（圖4e，f和g）。隨著萬壽菊提取物濃度升高ZM9的菌落數(shù)明顯增加，但未達(dá)顯著差異水平（t-test，P>0.05），而YH-22的菌落數(shù)隨著萬壽菊提取物濃度升高顯著增加（t-test，P<0.05）（圖4h）。

2.5??復(fù)合菌劑和協(xié)同菌劑對(duì)青枯菌抑制效果分析??利用平板對(duì)峙法分析復(fù)合菌劑和協(xié)同菌劑對(duì)青枯菌的抑制作用，結(jié)果顯示復(fù)合菌劑對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑為（18.13±3.26） mm，協(xié)同菌劑對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑為（27.94±4.21） mm，均比對(duì)照大，且協(xié)同菌劑抑菌圈直徑顯著大于復(fù)合菌劑抑菌圈直徑（t-test， P=0.011）（圖5 a、b、c和 g）。平板菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，對(duì)照組、復(fù)合菌劑組和協(xié)同菌劑組青枯菌菌落個(gè)數(shù)分別為342.33±19.29、195.67±21.73和150.33±14.29（圖5 d、e和f）。復(fù)合菌劑組青枯菌菌落個(gè)數(shù)顯著少于對(duì)照組（t-test，P=0.001），協(xié)同菌劑組青枯菌菌落個(gè)數(shù)顯著少于復(fù)合菌劑組（t-test，P=0.047）（圖5 h）。

3??討論

煙草青枯病生物防治方法因其安全無公害和長效等優(yōu)點(diǎn)成為煙草青枯病防治的熱點(diǎn)[2，7]，其中復(fù)合生防菌的應(yīng)用成為主流[5，9]。將功能互補(bǔ)的生防細(xì)菌或真菌復(fù)配混合，從而提高對(duì)作物土傳病害的防治效果，達(dá)到高產(chǎn)的目的，已成為一種經(jīng)濟(jì)高效的大田作物生防方式。與單一生防菌相比，復(fù)合菌劑的防治效果更明顯。Akila等[21]將真菌

20EC、熒光假單胞桿菌Pf1和枯草芽孢桿菌TRC54復(fù)配混合后，其對(duì)溫室和大田香蕉枯萎病均有明顯的防治效果;沈建平等[22]將黑曲霉，枯草芽孢桿菌、酵母、蠟狀芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌混合成的菌劑QR-1施于煙田，煙草青枯病的發(fā)病率明顯降低，防控效果達(dá)67%。該試驗(yàn)中的2種生防菌ZM9和YH-22復(fù)配后對(duì)煙草青枯菌抑制效果明顯，ZM9和YH-22對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑分別為（6.87±1.54）和（9.23±1.30）mm，ZM9和YH-22混合后對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑為（18.13±3.26）mm，ZM9和YH-22混合對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑顯著大于ZM9和YH-22抑菌圈直徑（t-test， PZM9=0.015，PYH-22=0.032），與前人研究結(jié)論一致。

植物的花、莖、葉和根中含有大量的抑菌物質(zhì)[23-24]，但將植物內(nèi)源性物質(zhì)與生防拮抗菌聯(lián)合施用的研究并未得到重視，主要原因是植物源具有廣譜殺菌性，難以與生防菌共存，

而當(dāng)二者的抑菌物質(zhì)能有效互作時(shí)，可達(dá)到更佳的抑菌效果。夏艷[25]將菌株H19與公丁香提取液以7：3的體積比進(jìn)行復(fù)配組合，對(duì)煙草青枯菌的防效達(dá)64.29%;Latha等[26]將菌株P(guān)f1、Py15、Bs16和大蒜提取液復(fù)配對(duì)番茄早疫病的防效達(dá)87%。但未有萬壽菊和青枯菌拮抗菌復(fù)配防控?zé)煵萸嗫菥难芯?。該試?yàn)在0、5和10 g/L萬壽菊提取物條件下，青枯菌菌落數(shù)分別為543.67±64.45、378.67±48.95和164.67±53.51，說明萬壽菊對(duì)青枯菌抑制效果隨著使用量增強(qiáng)而增強(qiáng);另外，萬壽菊對(duì)拮抗菌有一定的促進(jìn)作用，ZM9和YH-22菌落數(shù)隨著萬壽菊提取物的增加而增加;ZM9和YH-22組成的復(fù)合菌劑對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑為（18.13±3.26）mm;ZM9，YH-22和萬壽菊提取物組成的協(xié)同菌劑對(duì)青枯菌的抑菌圈直徑為（27.94±4.21）mm。因此萬壽菊提取物的加入對(duì)青枯菌的抑制作用明顯。

將植物提取物和拮抗菌配制成協(xié)同菌劑既綠色環(huán)保，提高抑菌效果，還能制成可濕性粉劑，保存時(shí)間更長，運(yùn)輸更方便且定殖能力更強(qiáng)。該研究的創(chuàng)新之處在于在復(fù)合菌劑中添加拮抗煙草青枯菌的物質(zhì)——萬壽菊根莖提取物，提高抑菌效率，便于存放和運(yùn)輸，這將是研發(fā)綠色高效健康的協(xié)同菌劑的主要方向。

4??結(jié)論

萬壽菊對(duì)煙草青枯菌具有很好的抑制作用;萬壽菊可以與青枯病拮抗菌聯(lián)合使用提高拮抗菌生物量，增強(qiáng)青枯菌抑制效果。

參考文獻(xiàn)

[1]YULIAR，NION Y A，TOYOTA K.Recent trends in control methods for bacterial wilt diseases caused by Ralstonia solanacearum[J].Microbes Environ，2015，30（1）：1-11.

[2] 何明興，沈亮，邱恒良，等.煙草青枯病的發(fā)生及防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2019（1）：111-112，115.

[3] 陳進(jìn)，魏凱.煙草青枯病防治技術(shù)研究現(xiàn)狀[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2017，37（20）：35.

[4] 施河麗，孫立廣，譚軍，等.生物有機(jī)肥對(duì)煙草青枯病的防效及對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響[J].中國煙草科學(xué)，2018，39（2）：54-62.

[5] 張仁軍，魏剛，楊兆忠，等.幾種生物菌劑防治煙草青枯病藥效試驗(yàn)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2019（6）：79-81.

[6] JANSE J D，WENNEKER M.Possibilities of avoidance and control of bacterial plant diseases when using pathogen-tested （certified） or-treated planting material[J].Plant pathology，2002，51（5）：523-536.