王雪雪 常旭 歐紅利 江倫 陶柱萍 厲穎 張成桂 劉衛(wèi)紅 高鵬飛 白麗

摘要??[目的]比較分析短肽HFDT1對MFC荷瘤小鼠抗腫瘤作用的肝臟代謝組學機制。[方法]將12只BALB/c小鼠于接種腫瘤細胞次日（0.2 mL/只），隨機分為模型組與HFDT1組，每組6只，模型組給予生理鹽水灌胃，20 mL/kg，1次/d;HFDT1組給予人工合成短肽HFDT1（7.8 mg/kg，10 mL/kg）腹腔注射，1次/d，連續(xù)10 d給予藥物處理，于末次給藥24 h后，收集小鼠肝臟組織。采用1 H NMR代謝組學技術分析小鼠肝臟代謝譜圖差異，運用PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析方法篩選有顯著性差異代謝物，探索短肽HFDT1對MFC荷瘤小鼠抗腫瘤作用的代謝通路。[結果]與模型組相比，短肽HFDT1給藥組最終確定了涉及5個代謝通路變化的7種具有顯著性差異的代謝物：丙酮酸水平顯著下調，磷脂酰膽堿-NCH2、GPC、肝糖、酪氨酸、煙酰胺及肌苷水平顯著上調。[結論]短肽HFDT1的抗腫瘤作用機制與抑制糖酵解，調節(jié)酪氨酸代謝、核苷酸代謝、煙酰胺代謝及膽堿磷酸化紊亂密切相關。

關鍵詞??短肽HFDT1;MFC;1H NMR;代謝組學;抗腫瘤

中圖分類號??R??961.1文獻標識碼??A

文章編號??0517-6611（2020）04-0088-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.026

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Preliminary Metabolomics Research on Anti-tumor Effect of Short Peptide-HFDT1 on MFC Tumor-Bearing Mice

WANG Xue-xue1，CHANG Xu2，OU Hong-li2 et al??（1.School of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000;2.School of Basic Medical Sciences，Dali University，Dali，Yunnan 671000）

Abstract??[Objective] To compare and analyze the liver metabolic mechanism of anti-tumor effect of short peptide HFDT1 on MFC tumor-bearing mice.[Method]Twelve BALB/c mice were randomly divided into model group （n=6） and HFDT1 group （n=6） after tumor vaccination.The model group was given normal saline perfusion，20 mL/kg，s.i.d; HFDT1 group was given intraperitoneum injection of synthetic short peptide-HFDT1，7.8 mg/kg，10 mL/kg，s.i.d，ten days after treatment，the liver tissues of mice were collected when 24 hours after the last administration.The differences of liver metabolic spectra in mice were analyzed by 1H NMR metabolomic.The differential metabolites were screened by PCA，PLS-DA and OPLS-DA，and the metabolic pathway of short peptide-HFDT1 on MFC tumor-bearing mice was explored.[Result]Compared with the model group，seven differential metabolites involving the changes of five metabolic pathways were finally identified in the short peptide-HFDT1 administration group，which showed that pyruvate levels were significantly down-regulated and phosphatidylcholine-NCH2，GPC，glycogen，tyrosine，nicotinamide and inosine levels were remarkably up-regulated.[Conclusion]The anti-tumor mechanism of short peptide-HFDT1 is closely related to the inhibition of glycolysis and the regulation the disorder of tyrosine metabolism，nucleotide metabolism，niacinamide metabolism，and choline phosphorylation.

Key words??Short peptide-HFDT1;MFC;1H NMR;Metabolomics;Anti-tumor

胃癌是世界上發(fā)病率最高、最致命的惡性腫瘤之一，其在我國的發(fā)病率很高;據(jù)報道，我國每10萬人中就有29.9例被確診為胃癌患者，每年有22 478人死于胃癌，約占世界胃癌死亡人數(shù)的1/2[1-2]。代謝組學在發(fā)現(xiàn)生物標志物、藥理藥效評價及作用機制研究等方面都發(fā)揮著重要作用，已被廣泛應用到癌癥研究中[3-6]。目前常見的代謝組學分析平臺有核磁共振波譜（NMR）和質譜。其中，NMR基于良好的重現(xiàn)性、樣品制備簡單及無損檢測等優(yōu)點，成為目前常用而有力的代謝組學分析工具[7]。

短肽HFDT1是從美洲大蠊精制物CII3中分離到具有抗腫瘤活性的含12個氨基酸殘基的短肽，并根據(jù)其序列人工合成。筆者所在課題組在前期研究中已證實，短肽HFDT1能夠抑制腫瘤的生長、增強荷瘤小鼠特異性免疫和非特異免疫的抗腫瘤功效，且無毒副作用[8-9]，但它的具體作用機制尚有待深入研究。

有研究報道，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與體內代謝的變化密切相關[3]。該研究采用1H NMR代謝組學技術，探索短肽HFDT1對MFC荷瘤小鼠的抗腫瘤作用機制，通過分析模型組與短肽HFDT1給藥組小鼠肝臟代謝譜的差異，篩選鑒定與MFC荷瘤小鼠抗腫瘤作用相關的有顯著性差異代謝物，以期為研究短肽HFDT1抗腫瘤作用提供新的思路。

1??材料與方法

1.1??材料

1.1.1??動物。

SPF級BALB/c小鼠，6周齡，體質量18～20 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SYXK（湘）2016-0002。

1.1.2??腫瘤細胞株。

小鼠胃癌細胞（MFC），源于615小鼠胃癌組織，屬于上皮腫瘤細胞系，細胞株保有血道轉移的特性，購自于中國科學院生物化學與細胞生物學研究所（原中國科學院上海細胞生物學研究所）。

1.1.3??主要儀器。

Bruker 800 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）;組織破碎儀[邁爾萊客（廣州）工業(yè)技術有限公司];低溫高速離心機（西格瑪實驗室離心機公司）;冷凍干燥機[金西盟（北京）儀器有限公司];真空離心濃縮儀（北京照生行儀器設備有限公司）。

1.1.4??受試藥物。短肽HFDT1從美洲大蠊精制物CII3中分離到具有抗腫瘤活性的含12個氨基酸殘基的短肽，并根據(jù)其序列人工合成（專利號：2017100567877，專利申請人：大理大學，由大理大學云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室提供）[8-9]。

1.1.5??主要試劑及用品。

磷酸二氫鈉（NaH2PO4，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150417）;磷酸氫二鉀（K2HPO4，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150312）;FCS（Gibco公司）;RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）;Cell Strainer（BD公司）。

1.2??方法

1.2.1??腫瘤細胞體外培養(yǎng)及荷瘤小鼠模型建立。

取MFC細胞株常規(guī)復蘇，用10% FCS-RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用PBS將細胞數(shù)調整為1×107/mL，0.2 mL/只，接種于小鼠右側腋下。

1.2.2??分組及給藥。

于接種腫瘤后次日，將小鼠隨機分2組，即模型組（M組）和短肽HFDT1給藥組（HFDT1組），每組6只。模型組給予生理鹽水灌胃（20 mL/kg，1次/d）;HFDT1組給予人工合成短肽HFDT1（7.8 mg/kg，10 mL/kg，1次/d）腹腔注射，連續(xù)10 d給予藥物處理。

1.2.3??肝臟樣本的收集與處理。

于末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死所有小鼠，取肝臟組織置于-80 ℃保存。試驗前室溫解凍，取肝臟0.1 g，加入CH3OH/H2O溶液進行勻漿，12 000 r/min離心10 min，4 ?℃，取上清液。經(jīng)濃縮、冷凍干燥后得凍干粉。加K2HPO4/NaH2PO4緩沖液，渦旋混勻，12 000 r/min低溫離心10 min，取上清液，置于-80 ℃保存，待1H NMR檢測分析。

1.2.4??核磁數(shù)據(jù)處理與分析。

在Topspin軟件中對小鼠肝臟代謝組學原始圖譜進行處理，并將歸一化后數(shù)據(jù)錄入SIMCA-P 13.0軟件中進行主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），考察肝臟樣本總體代謝譜圖分布狀況。為使組間差異最大化，利于尋找組間差異性代謝物，采用正交最小二乘法判別分析法（OPLS-DA）對數(shù)據(jù)進行分析，所有的分析結果均以得分圖表示。最終根據(jù)多元分析結果，結合HMDB數(shù)據(jù)以及相關文獻，初步確定短肽HFDT1對MFC荷瘤小鼠肝臟作用的差異性代謝物，并對其進行生化解釋。

2??結果與分析

2.1??模型組與短肽HFDT1組小鼠腫瘤形態(tài)學觀察

頸椎脫臼處死小鼠后，無菌收集小鼠腫瘤置于培養(yǎng)皿中，拍照。如圖1所示，模型組腫瘤顏色鮮紅且體積較大，HFDT1組與模型組相比，腫瘤體積明顯縮小。這表明成功復制了課題組前期研究結果——短肽HFDT1能夠抑制腫瘤的生長[8-9]。

2.2??短肽HFDT1對MFC荷瘤小鼠代謝組學研究

2.2.1??多元數(shù)據(jù)分析。

首先進行PCA分析，該數(shù)學模型可以從整體上觀察2組間的分類趨勢和離散點。如圖2所示，每一個點代表1個樣本，模型組（M組）與HFDT1組雖然有分離趨勢，但樣本離散程度較大。

由PLS-DA得分圖（圖3A）可以看出，2組間樣本表現(xiàn)出一定的聚類現(xiàn)象。在PLS-DA模型成立的基礎上，對原始數(shù)據(jù)建立200次排列試驗（圖3B），結果顯示隨機變量Y變量產(chǎn)生的R2、Q2均小于原始值，表明該模型有效可靠。為凸顯組間差異，提高模型的準切性和預測能力，以便找出貢獻于組間分離的主要差異性物質，使用OPLS-DA分析方法對數(shù)據(jù)進行進一步的分析。

由OPLS-DA得分圖（圖4A）可以看出，模型組與HFDT1組之間樣本距離較遠，組內樣本聚類現(xiàn)象明顯。模型驗證結果表明，該模型具有良好的預測能力，且不存在過度擬合。此外，相應的三維得分圖（圖4B）顯示，模型組與HFDT1組沿t[1]軸方向分離，各組內樣本表現(xiàn)出聚類現(xiàn)象?；谝陨系臄?shù)據(jù)分析結果，提示短肽HFDT1組與模型組小鼠體內存在代謝差異。

2.2.2??差異代謝物的確定。

根據(jù)多元分析結果，比對HMDB數(shù)據(jù)庫及參考相關文獻，篩選出模型組與短肽HFDT1組之間具有顯著性差異的代謝物。如表1所示，與模型組相比，小鼠肝臟中共篩選出7種差異性代謝物，除丙酮酸（pyruvate）外，磷脂酰膽堿-NCH2（phosphatidylcholine-NCH2）、甘油磷酸膽堿（glycerol phosphatidylcholine，GPC）、酪氨酸（tyrosine）、肝糖（glycogen）、肌苷（inosine）及煙酰胺（niacinamide）水平均在HFDT1組顯著上調。這些代謝物分別涉及糖酵解、酪氨酸代謝、煙酰胺代謝、核苷酸代謝及膽堿磷酸化代謝通路。

3??討論

胃癌是一種代謝性疾病，在癌細胞的增殖和侵襲過程中，機體代謝網(wǎng)絡會發(fā)生紊亂，其代謝產(chǎn)物也會隨之產(chǎn)生變化[10]。

課題組之前的試驗證明，短肽HFDT1具有抗腫瘤作用[8-9]，但其作用機制尚未完全揭示。故該試驗嘗試通過1H NMR代謝組學技術，探究短肽HFDT1對MFC荷瘤小鼠體內代謝的影響，揭示其可能的代謝通路，探索其抗腫瘤作用。該研究發(fā)現(xiàn)短肽HFDT1對腫瘤細胞的生長具有比較明顯的抑制作用，其抗腫瘤作用機制可能與調控涉及糖酵解、酪氨酸代謝、核苷酸代謝、煙酰胺代謝及膽堿磷酸化代謝通路關系密切。

3.1??糖酵解

許多研究證實，即使在氧充足條件下，腫瘤細胞也仍然以糖酵解為主要的供能方式，即有氧糖酵解—Warburg效應[11]。低氧條件下，腫瘤細胞大量攝取葡萄糖，由糖酵解生成的丙酮酸經(jīng)乳酸脫氫酶轉化為乳酸，為其自身的分化與增長提供能量。丙酮酸為糖酵解過程和TCA循環(huán)的關鍵中間樞紐點，在機體發(fā)生能量代謝紊亂時，丙酮酸的水平會出現(xiàn)異常增加。研究顯示[12]，臨床四期胃癌患者血清丙酮酸水平異常增高。Zhang等[13]基于1H NMR代謝組學技術發(fā)現(xiàn)患者胃癌組織中丙酮酸含量呈現(xiàn)高水平表達。該試驗小鼠肝臟中丙酮酸含量在給予短肽HFDT1治療后顯著下調，同時肝糖水平顯著升高，提示短肽HFDT1可以抑制糖酵解速率，減少腫瘤細胞的能量供給，減緩腫瘤細胞的增長速度。

3.2??煙酰胺代謝

有研究表明，煙酰胺在腫瘤患者血漿中低表達，煙酰胺可以通過促進RUNX3基因的表達，從而抑制人膀胱腫瘤移植瘤及致癌原誘導的鼠膀胱腫瘤的生長速度[14-15]。該試驗中，HFDT1組煙酰胺水平顯著升高，提示HFDT1可能通過提高煙酰胺水平，促使RUNX3基因的表達，抑制小鼠胃癌細胞的生長與增殖。

3.3??核苷酸代謝

腫瘤細胞處于快速增殖和分化狀態(tài)，核苷酸合成和代謝頻率明顯升高;在胃癌患者或動物模型中，以核苷酸分解代謝產(chǎn)物尿酸或尿酸鹽的積累為主要特征[10]。有文獻報道[16]，肌苷在體內參與細胞的能量代謝和蛋白質的合成，提高相關代謝酶的活性，發(fā)揮保護細胞作用，并作為在細胞缺氧條件下產(chǎn)生ATP的替代能量來源。此外，肌苷還具有抗氧化應激的作用[17]。Nie等[18]基于UHPLC-Q-TOF/MS代謝組學技術發(fā)現(xiàn)與胃癌裸鼠模型組相比，改良后四君子湯治療組裸鼠血漿中肌苷水平顯著增加。該試驗中，在給予短肽HFDT1治療后，小鼠肝臟中的肌苷水平顯著上升，與上述文獻報道結果一致。試驗結果提示短肽HFDT1可能通過抑制肌苷分解速率，增加肌苷含量，恢復低能缺氧狀態(tài)下細胞的正常代謝，減輕機體的氧化應激損傷。

3.4??酪氨酸代謝

在腫瘤代謝組學的研究中，多種氨基酸被認為是有助于研究多種惡性腫瘤的潛在生物標志物[19]。根據(jù)文獻報道，腫瘤細胞為滿足自身急劇增長的蛋白質合成需求，需要在癌癥病灶周圍累積足夠的芳香族氨基酸，如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等[20]。該試驗中，HFDT1組酪氨酸水平明顯上調，這一結果可能與短肽HFDT1抑制腫瘤細胞的增長與分化，導致體內酪氨酸的大量堆積有關。

也有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血漿中酪氨酸含量異常減少[21]，這可能是機體代償反應的作用結果，同時也說明酪氨酸代謝在腫瘤中的作用有待進一步深入研究。

3.5??膽堿磷酸化

腫瘤中膽堿磷酸化的紊亂通常伴隨著含膽堿代謝物的改變，其中，在多種癌癥患者中磷酸膽堿（PC）和GPC水平增加得到了廣泛報道[22]。膽堿、PC和GPC在膽堿磷酸化過程中可相互轉化，對細胞膜的生物合成與降解有非常重要的意義。該研究中，與模型組相比，HFDTI組小鼠肝臟中磷脂酰膽堿-NCH2和GPC含量呈現(xiàn)上升趨勢，提示生物膜的合成需求升高，這一需求可能是為了滿足肝臟的自身修復。結果表明短肽HFDT1可能通過調節(jié)膽堿磷酸化，起到修復受損細胞膜的作用。

4??結論

該研究基于NMR代謝組學方法，分析了MFC荷瘤小鼠模型組與短肽HFDT1給藥組肝臟的代謝組特征以及組間的代謝組差異，發(fā)現(xiàn)MFC荷瘤小鼠給藥后，肝臟中涉及糖酵解、酪氨酸代謝、核苷酸代謝、煙酰胺代謝及膽堿磷酸化代謝通路的多種代謝物水平異常變化，這些代謝通路的變化可能是短肽HFDT1的作用結果，初步揭示了其抗腫瘤作用與調節(jié)機體代謝紊亂密切相關。此外，該研究也提示代謝組學技術可以從整體上評價分析藥物的作用機制，有可能為抗癌藥物的篩選與研發(fā)提供了新思路。

該試驗初步揭示了短肽HFDT1對MFC荷瘤小鼠抗腫瘤作用，在后續(xù)研究中，可考慮采用動態(tài)觀察代謝物變化（多個時間點采樣）及結合其他技術，如與LC/MS、蛋白質組學聯(lián)用等，從多方面、多角度更加深入探究短肽HFDT1抗腫瘤的作用機制。

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