陳玉斌 張新偉 顧家屹 王曉林 李佳萌 謝鯤鵬

摘要??在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量的Ca2+和Zn2+，研究其對金針菇菌絲生長、生物量以及多糖含量的影響。結(jié)果表明，固體培養(yǎng)時(shí)，Ca2+濃度為1 000～9 000 mg/L促進(jìn)菌絲的生長，當(dāng)濃度超過12 000 mg/L時(shí)抑制菌絲的生長;Zn2+濃度為10～100 mg/L時(shí)促進(jìn)菌絲的生長，當(dāng)Zn2+濃度超過150 mg/L時(shí)抑制菌絲的生長。液體培養(yǎng)時(shí)，Ca2+濃度為5 000 mg/L時(shí)，菌絲體多糖含量最多，相比對照組提高139.2%;Zn2+濃度為6 mg/L時(shí)，菌絲體多糖含量最大，相比對照組增加141.8%。

關(guān)鍵詞??鈣離子;鋅離子;金針菇菌絲

中圖分類號??S??646.1+5文獻(xiàn)標(biāo)識碼??A文章編號??0517-6611（2020）04-0043-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.013

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effects of Calcium Ion and Zinc Ion on the Mycelium Growth of Flammulina velutipes

CHEN Yu-bin，ZHANG Xin-wei， ?GU Jia-yi ?et al

（School of Life Science，Liaoning Normal University， Dalian，Liaoning 116081）

Abstract??Different quality of Ca2+ and Zn2+ were added to the culture medium to study the effects on the growth morphology， biomass， and polysaccharide content of the mycelium of Flammulina velutipes. The results showed that in the solid culture， when the concentration of Ca2+ was 1 000-9 000 mg/L， the growth of mycelia was promoted. When the concentration was over 12 000 mg/L， the growth of mycelia was inhibited; when the concentration of Zn2+ was 10-100 mg/L， the growth was accelerated. When the concentration of Zn2+exceeded 150 mg/L， the growth of mycelia was inhibited. In the liquid culture， when the concentration of Ca2+ was 5 000 mg/L， the polysaccharide content of mycelia was the highest， which was 139.2% higher than that of the control group. When the concentration of Zn2+ was 60 mg/L， the polysaccharide content of the mycelia was the highest， which was increased by 141.8% compared with the control group.

Key words??Calcium ion;Zinc ion;F. velutipes mycelium

金針菇（Flammulina velutipes）又稱構(gòu)菌、金菇等，在真菌分類學(xué)上隸屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota），傘菌綱（Agaricaceae），傘菌目（Agaricales），小火焰菌屬（Flamingo），是一種菌藻地衣類[1]。金針菇含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，富含人體必需的各種氨基酸，其中含量較高的是賴氨酸和精氨酸，遠(yuǎn)高于其他種類的食用菌，有利于對兒童的智力發(fā)育 [2-3]。金針菇還可以抗癌、增強(qiáng)人體肌體的免疫能力，是我國著名的功能性營養(yǎng)保健食品[4]。

研究表明，鈣離子是構(gòu)成細(xì)胞壁不可缺少的重要物質(zhì)、某些酶的活化劑，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓[5];鋅離子可以維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，作為酶的組成部分、酶類的激活劑，能夠參與氧化還原反應(yīng)，促進(jìn)食用菌菌絲體及子實(shí)體的生長，從而提高食用菌的質(zhì)量及營養(yǎng)價(jià)值[6]。目前已成功應(yīng)用在多種食用菌的栽培上，但關(guān)于鈣離子和鋅離子對金針菇菌絲生長影響的研究尚未見報(bào)道。因此，筆者通過研究鈣離子和鋅離子對金針菇菌絲生長及多糖含量的影響，探尋能減少金針菇菌絲生長周期且不影響菌種質(zhì)量的金屬離子濃度范圍，提高金針菇的產(chǎn)量。

1??材料與方法

1.1??菌種與試劑

金針菇菌種，由遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

硫酸鈣（CaSO4·2H2O）和硫酸鋅（ZnSO4·7H2O），均為分析純產(chǎn)品。

1.2??培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基用途及配方見表1。

1.3??試驗(yàn)方法

1.3.1??金針菇菌種的制備方法。

①固體菌種的制備：無菌操作條件下，將冰箱保存的金針菇菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)6～7 d，直到菌絲長滿平板即可使用[7]。

②液體菌種的制備：無菌操作條件下，將活化后的金針菇菌種挑取1塊2 cm2左右的菌絲體接種在裝有100 mL PDB培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)48 h。然后置于28 ℃、120 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)6 d，制成液體菌種備用[8]。

1.3.2??培養(yǎng)方法。

1.3.2.1??PDA固體平板培養(yǎng)。

將硫酸鈣和硫酸鋅各自添加到PDA培養(yǎng)基中，濃度見表2。滅菌后取出，冷卻至50 ℃左右時(shí)，搖勻培養(yǎng)基后倒平板，待凝固后分別接入直徑5 mm的金針菇菌種，每個(gè)濃度設(shè)置3次重復(fù)，共36個(gè)平板[9]。每個(gè)平板做好標(biāo)記后置于恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)5 d，溫度設(shè)置為28 ℃，記錄菌絲體的長勢，測量固體培養(yǎng)后金針菇菌落的直徑，計(jì)算菌絲的生長速率[5，10]。

1.3.2.2??PDB液體搖瓶培養(yǎng)。

將硫酸鈣和硫酸鋅各自添加到PDB培養(yǎng)基中，濃度見表2。無添加為對照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。250 mL錐形瓶裝液100 mL，高壓滅菌，設(shè)置溫度121 ℃、時(shí)間20 min，冷卻至室溫后接入5%的液體菌種，然后置于28 ℃、120 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)3 d，測定菌絲生物量（菌絲的濕重和干重）[9]。

1.4??測定項(xiàng)目與方法

1.4.1??金針菇菌絲生長的觀察。

記錄菌絲的生長形態(tài)，測量菌落直徑，并按照下列公式計(jì)算菌絲的生長速率。

計(jì)算公式：菌絲生長速率=菌落直徑/菌絲生長天數(shù)[10-12]。

1.4.2??金針菇菌絲生物量。

取液體培養(yǎng)的培養(yǎng)液，4 000 r/min，離心20 min，取出后水洗，再次離心。收集菌絲體，電子天平稱重，重復(fù)3次，平均值即為菌絲體的濕重[9]。

1.4.3??金針菇菌絲多糖的提取和測定。

多糖的提?。簩⑴囵B(yǎng)液于4 000 r/min離心20 min，常壓蒸發(fā)上清液，濃縮至20%，濃縮液與95%的乙醇1∶3醇析12 h，繼續(xù)4 000 r/min離心12 min，得到的沉淀用無水乙醇、丙酮各洗一次，于60 ℃干燥箱內(nèi)烘干，得到灰白色多糖[5，8]

多糖的測定：采取苯酚-硫酸法，以硫酸、苯酚作為顯色劑，它們與金針菇多糖發(fā)生顯色反應(yīng)，在490 nm處有最大峰值，測定吸光度，吸收值和多糖含量呈線性關(guān)系，通過已獲得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算金針菇菌絲體中的多糖含量[6，11]。

2??結(jié)果與分析

2.1??Ca2+對金針菇菌絲生長的影響

2.1.1??菌絲生長形態(tài)。

不同濃度的Ca2+對金針菇菌絲生長形態(tài)的影響見圖1。由圖1可知，金針菇菌種在Ca2+處理下，長勢基本良好，菌絲較細(xì)密;當(dāng)Ca2+濃度在2 000～9 000 mg/L時(shí)菌落生長茂盛，菌絲細(xì)密;當(dāng)Ca2+濃度為5 000 mg/L時(shí)，金針菇菌絲長勢較好;當(dāng)濃度超過12 000 mg/L時(shí)抑制菌絲生長。

2.1.2??菌絲生物量。

不同濃度的Ca2+對金針菇菌絲濕重的影響見圖2。由圖2可知，當(dāng)Ca2+濃度為1 000～9 000 mg/L時(shí)菌絲體濕重高于對照組，當(dāng)Ca2+濃度為5 000 mg/L時(shí)明顯促進(jìn)金針菇菌絲生長，比對照組的菌絲體濕重增加5.3 g，提高44.2%，當(dāng)Ca2+濃度為12 000 mg/L明顯抑制金針菇菌絲生長。

2.1.3??菌絲多糖含量。

將添加不同濃度Ca2+的培養(yǎng)液離心，取上清液，加水稀釋50倍，在490 nm處測定吸光值，由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)多糖含量，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，Ca2+濃度在1 000～9 000 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組的多糖含量均高于對照組，可見，Ca2+能夠促進(jìn)多糖積累，尤其是在5 000 mg/L時(shí)，多糖含量最大，達(dá)89.2 mg，比對照組提高139.2%。而Ca2+濃度為12 000 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組的多糖含量明顯少于對照組，說明Ca2+濃度為12 000 mg/L時(shí)抑制多糖的積累。

2.2??Zn2+對金針菇菌絲生長的影響

2.2.1??菌絲生長形態(tài)。

不同濃度的Zn2+對金針菇菌絲生長形態(tài)的影響見圖4。由圖4可知，當(dāng)Zn2+濃度在60～100 mg/L時(shí)促進(jìn)金針菇菌絲的生長，當(dāng)Zn2+濃度為60 mg/L時(shí)明顯促進(jìn)金針菇菌絲生長，菌落嫩白，菌絲細(xì)密，比對照組的菌絲體濕重增加4.2 g，提高了35%;當(dāng)Zn2+濃度達(dá)150 mg/L時(shí)抑制菌絲生長，菌落較小、邊緣發(fā)黃，生長速率較慢。

2.2.2??菌絲生物量。

不同濃度的Zn2+對金針菇菌絲濕重的影響見圖5。由圖5可知，當(dāng)Zn2+濃度為10～100 mg/L時(shí)菌絲體濕重高于對照組，當(dāng)Zn2+濃度為60 mg/L時(shí)明顯促進(jìn)金針菇菌絲生長，比對照組的菌絲體濕重增加4.2 g，提高35%，當(dāng)Zn2+濃度為150 mg/L明顯抑制金針菇菌絲生長。

2.2.3??菌絲多糖含量。

將添加不同濃度Zn2+的培養(yǎng)液離心，取上清液，加水稀釋50倍，在490 nm處測定吸光值，由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)多糖含量。結(jié)果見圖6。由圖6可知，Zn2+濃度在10～100 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組的多糖含量均高于對照組，由此可見，Zn2+能夠促進(jìn)多糖積累，尤其是在60 mg/L時(shí)，多糖含量最大，達(dá)90.1 mg，比對照組提高1418%。而Zn2+濃度為150 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組的多糖含量明顯少于對照組，說明Zn2+濃度為150 mg/L時(shí)抑制多糖的積累。

3??結(jié)論

該試驗(yàn)研究Ca2+和Zn2+對金針菇菌絲生長的影響，采用PDA平板和液體搖瓶培養(yǎng)的方法，分別對菌絲生長、生物量和多糖含量等進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在PDA固體平板上，Ca2+濃度為5 000 mg/L時(shí)明顯促進(jìn)菌絲的生長;在液體搖瓶中Ca2+濃度為1 000～9 000 mg/L時(shí)促進(jìn)金針菇菌絲生長，當(dāng)

Ca2+濃度為5 000 mg/L時(shí)明顯促進(jìn)菌絲生長，濕重提高44.2%，多糖含量相比對照組提高139.2%。在PDA固體平板上，Zn2+促進(jìn)金針菇菌絲生長的濃度為30～100 mg/L，當(dāng)濃度為60 mg/L時(shí)明顯促進(jìn)菌絲的生長，當(dāng)濃度達(dá)150 mg/L時(shí)抑制菌絲生長;在液體搖瓶中，當(dāng)濃度為60 mg/L時(shí)明顯促進(jìn)菌絲的生長，菌絲體濕重提高35%，多糖提高了141.8%;當(dāng)Zn2+濃度超過60 mg/L促進(jìn)作用均越來越小;當(dāng)Zn2+濃度達(dá)150 mg/L時(shí)，上述組別均小于對照組。

為了提高金針菇的產(chǎn)量，縮短金針菇生長周期，且不影響金針菇質(zhì)量，越來越多的人關(guān)注將微量元素和金屬離子元素應(yīng)用于金針菇的栽培[5，6，8，9]，該試驗(yàn)結(jié)果為金針菇菌絲的栽培提供啟示，但需要注意的是，該試驗(yàn)僅限于研究單一金屬離子對金針菇菌絲生長的影響，對于2種金屬離子復(fù)合添加時(shí)之間的相互關(guān)系并未涉及，在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步展開。

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