金領(lǐng)微 潘 敏 葉菡洋 陳 琰 葉白如 鄭 育 潘殊方 施 珍 張 靜

腎缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion，I/R)是急性腎衰竭的常見原因，與住院時(shí)間長(zhǎng)、病死率高有關(guān)，在腎移植、心血管手術(shù)等許多臨床環(huán)境中不可避免[1]。腎I/R損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，其機(jī)制是多因素和相互依賴的，其中包括氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)應(yīng)激是過度I/R狀態(tài)的結(jié)果之一，研究表明ER應(yīng)激可激活自噬[2,3]。自噬作用是一個(gè)保守的分解代謝過程，主要功能是降解損傷、錯(cuò)誤折疊或聚集蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器。此外，ROS被發(fā)現(xiàn)在自噬過程中發(fā)揮重要作用，這表明氧化應(yīng)激和自噬密切相關(guān)[4]。同樣，炎癥過程被認(rèn)為是腎I/R損傷的關(guān)鍵機(jī)制， ROS是炎性反應(yīng)中的重要介質(zhì)[5]。故認(rèn)為ROS過度產(chǎn)生、炎性反應(yīng)、ER應(yīng)激和自噬之間存在密切聯(lián)系。

二甲雙胍作為經(jīng)典降糖藥，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用，它通過激活A(yù)MPK通路上調(diào)抗氧化的硫氧還蛋白的表達(dá)發(fā)揮其抗氧化活性，從而減弱ROS的過度形成[6]。此外，它還可抑制多種代謝性疾病相關(guān)的炎性因子[7]。二甲雙胍預(yù)處理減輕I/R損傷的有效性已有報(bào)道[1]。然而，其對(duì)腎I/R中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激自噬和炎性反應(yīng)的影響尚不清楚。因此，本研究著重闡述二甲雙胍和大鼠腎I/R后氧化應(yīng)激、炎癥、ER應(yīng)激和自噬的關(guān)系。

材料與方法

1.主要藥物與試劑:二甲雙胍購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及蛋白試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司；細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；GRP 78(#3183)、CHOP(#2895)、p-Eif2-α(#9721)、Beclin-1(#3738)、β-actin(#5125)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 公司；XBP-1(sc-8015)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；ATF-6α(SM7007P)購(gòu)自美國(guó)Acris Antibodies公司；LAMP-2(ab13524)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

2.動(dòng)物模型制備及分組：健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～250克，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2017-0005]。動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥麻醉(5%)，腎缺血再灌注操作按Mahfoudh-Boussaid等[8]所述的方法進(jìn)行，動(dòng)物進(jìn)行常規(guī)剖腹手術(shù)，并用平滑的血管鉗鉗住雙側(cè)腎蒂，導(dǎo)致局部缺血。將大鼠隨機(jī)分為3組(每組6只),即假手術(shù)組(Sham)：腎蒂切開，但血管未發(fā)生閉塞；缺血再灌注組(I/R)：大鼠腎臟缺血1h，再灌注2h；二甲雙胍組(metformin)：對(duì)動(dòng)物的處置與I/R組相同，但在模型建立前腹腔注射二甲雙胍0.125mg/(kg·d)，共14天，Sham組和I/R組給予等容量0.9%氯化鈉注射液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)大鼠實(shí)施安樂死，采集大鼠組織和血液樣本。

3.血漿肌酐和乳酸脫氫酶活性測(cè)定：采用AU5821全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman Coulter有限公司)測(cè)定血漿樣品中肌酐(Cr)和乳酸脫氫酶(LDH)含量。

4.抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化評(píng)估:根據(jù)說明書采用各試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，通過UV759紫外可見分光度計(jì)(上海圣科儀器設(shè)備有限公司)分別測(cè)定大鼠腎臟組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量。

5.蛋白印跡分析:按細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒說明操作，提取腎組織細(xì)胞核蛋白，蛋白濃度采用BCA 法測(cè)定，加入上樣緩沖液煮沸 5min，經(jīng)12% SDS-PAGE 凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉 2h，與一抗(GRP 78、CHOP、p-Eif2-α、Beclin-1、β-actin、XBP-1、ATF-6α、LAMP-2)1∶1000 在 4℃孵育過夜，TBST 洗膜，二抗(羊抗兔，1∶5000)室溫孵育 1h，洗膜，ECL 化學(xué)發(fā)光顯影。Image 6.0 軟件量化蛋白質(zhì)水平。

6.實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR):采用TRIzol試劑按說明書從腎組織中提取總RNA，分離RNA進(jìn)行定量及反轉(zhuǎn)錄。在循環(huán)的實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中對(duì)白介素(IL)1β、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR分析。β-actin作為內(nèi)參。引物序列如下：IL-1β, F：5′-CTCTGACAGGCAACCACTTAC-3′， R:5′-GTCCAAATTCAATTCATCCC-3′; IL-6, F: 5′-TTGCCTTCTTGGGACTGATG-3′, R: 5′-ACTGGTCTGTTGTGGGTGGT-3′; MCP-1, F: 5′-TTGCCTTCTTGGGACTGATG-3′, R: 5′-ACTGGTCTGTTGTGGGTGGT-3′; β-actin, F: 5′-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′, R: 5′- GCTAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3′。

7.腎組織學(xué)：腎活檢在10%的甲醛中固定，石蠟包埋，5μm切片，標(biāo)準(zhǔn)蘇木精-伊紅(HE)進(jìn)行染色。由經(jīng)驗(yàn)豐富的腎臟病理醫(yī)生在不知曉實(shí)驗(yàn)組的情況下進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估(每個(gè)腎取10個(gè)切片)，使用徠卡光鏡觀察，放大倍數(shù)400倍。采用Jablonski半定量評(píng)分(0～4分)評(píng)價(jià)腎小管損傷程度[9]。

結(jié) 果

1.二甲雙胍預(yù)處理對(duì)腎臟損傷及功能的影響:I/R組大鼠腎臟血漿肌酐濃度較假手術(shù)組明顯升高，而二甲雙胍治療可以緩解肌酐水平的升高(P<0.05)。腎損傷的結(jié)果與肌酐濃度一致，I/R組LDH明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。與I/R組比較，二甲雙胍預(yù)處理可顯著降低血漿中LDH的活性，詳見圖1。

圖1 3組血漿肌酐濃度(A)及乳酸脫氫酶活性(B)與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

2.二甲雙胍預(yù)處理對(duì)抗氧化酶活性和氧化應(yīng)激的影響：二甲雙胍預(yù)處理對(duì)維持抗氧化酶活性和腎組織氧化應(yīng)激程度的影響如圖2所示，與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠腎臟SOD、CAT、GPX活性和GSH含量較假手術(shù)組明顯下降，MDA濃度明顯增加 (P<0.05)，而二甲雙胍組顯著逆轉(zhuǎn)了所有這些結(jié)果(P<0.05)。

3.二甲雙胍預(yù)處理阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：免疫印跡分析二甲雙胍預(yù)處理對(duì)ER應(yīng)激的影響如圖3所示， GRP78、ATF-6α、p-eIF-2α、XPB-1和CHOP在I/R組水平高于假手術(shù)組(P<0.05)，而與I/R大鼠比較，二甲雙胍處理的大鼠蛋白的表達(dá)均明顯減弱(P<0.05)。

圖2 腎組織中SOD(A)、CAT(B)、GPX(C)、GSH(D)和MDA(E)水平與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

圖3 免疫蛋白印跡分析GRP 78、ATF-6、p-eIF-2α、XBP-1、CHOP的蛋白表達(dá)水平β-actin為內(nèi)參；與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

4.二甲雙胍預(yù)處理阻止自噬作用：自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LAMP-2來評(píng)估二甲雙胍對(duì)自噬通量的影響，如圖4所示，大鼠I/R后Beclin-1和LAMP-2的蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)。與I/R組比較，二甲雙胍處理的大鼠蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

圖4 免疫蛋白印跡分析Beclin-1和LAMP-2的蛋白表達(dá)水平β-actin為內(nèi)參；與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P <0.05

5.二甲雙胍預(yù)處理對(duì)炎癥的影響：對(duì)大鼠腎臟組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR以確定二甲雙胍預(yù)處理對(duì)炎性反應(yīng)的影響(圖5)，再灌注24h后，與假手術(shù)組比較，I/R大幅度增加炎性因子 (IL-1β、IL-6和MCP-1)的mRNA水平(P<0.05)。與I/R組比較，二甲雙胍處理能夠顯著降低再灌注24h后的促炎性因子的表達(dá)(P<0.05)。

圖5 RT-PCR分析 IL-1β(A)、IL-6(B)和MCP-1(C)基因表達(dá)水平與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

6.二甲雙胍處理后組織學(xué)改變：腎臟損傷的組織學(xué)特征證實(shí)了生化指標(biāo)的變化(圖6)，在I/R組觀察到嚴(yán)重的損傷，包括刷狀緣缺失、核凝結(jié)、細(xì)胞腫脹。與假手術(shù)組比較，I/R術(shù)后出現(xiàn)腫脹、細(xì)胞核丟失和出血。與I/R組比較，二甲雙胍預(yù)處理顯示腎損傷的組織學(xué)特征明顯減弱，腎損傷評(píng)分也顯著降低(P<0.05)。

圖6 腎臟組織的組織學(xué)照片(HE，×400)(A)及采用Jablonski評(píng)分評(píng)價(jià)腎損傷程度(B)藍(lán)色箭頭所指為刷狀緣缺失，紅色箭頭所指為管狀梗阻，H為出血，L為細(xì)胞核丟失；與Sham組比較，*P <0.05；與I/R組比較，#P <0.05

討 論

在I/R損傷下，二甲雙胍對(duì)腎臟組織的有益作用已得到充分證明[1, 6, 7]。然而，其對(duì)腎I/R損傷引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬信號(hào)通路的影響尚未闡明。因此，本研究旨在評(píng)估二甲雙胍預(yù)處理對(duì)腎I/R損傷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以降低氧化應(yīng)激，同時(shí)抑制炎性因子表達(dá)。同樣，這些機(jī)制之間的密切關(guān)系可能是由活性氧的過度形成所引起的，故二甲雙胍的保護(hù)作用可能通過清除活性氧發(fā)揮抗氧化功能。

本研究證實(shí)了關(guān)于腎I/R在功能和結(jié)構(gòu)改變方面的有害后果[8]。與假手術(shù)組比較，腎I/R結(jié)果顯著增加了血漿肌酐濃度和LDH活性，而二甲雙胍可顯著降低I/R大鼠的上述指標(biāo)。MDA水平也被稱為脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物，在I/R后增加[10]。與假手術(shù)組比較，二甲雙胍處理后細(xì)胞脂質(zhì)氧化顯著降低。這可以穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)膜和線粒體膜，因此有助于降低LDH釋放所出現(xiàn)的細(xì)胞溶解。這種細(xì)胞壞死的直接后果是維持腎臟結(jié)構(gòu)，特別是壞死細(xì)胞，腎小管充血和出血更少。既然自由基釋放或增加是細(xì)胞結(jié)構(gòu)氧化和降解的主要原因，可以認(rèn)為二甲雙胍的有益作用與抑制活性氧生成過多的作用密切相關(guān)。SOD代表機(jī)體清除自由基的能力，負(fù)責(zé)清除機(jī)體釋放自由基，SOD和CAT、GSH在正常生理狀態(tài)下能將體內(nèi)生成的氧自由基逐步催化還原，生成對(duì)人體無害的水和氧[11，12]。本研究證明了二甲雙胍處理通過增加抗氧化酶SOD、CAT、GPX的活性和GSH的水平來刺激細(xì)胞抵抗自由基，是一種抗氧化應(yīng)激的保護(hù)劑。這些結(jié)果表明，二甲雙胍的外源性供應(yīng)可以增強(qiáng)腎缺血大鼠的抗氧化能力。

氧化應(yīng)激通過破壞蛋白折疊通路和上調(diào)錯(cuò)誤折疊蛋白的產(chǎn)生而加劇ER應(yīng)激[13]。另一方面，ER應(yīng)激可通過ROS積累促進(jìn)氧化應(yīng)激[14]。研究表明腎I/R與GRP78、p-PERK、ATF4、ATF6、XBP-1、CHOP水平升高有關(guān)[8, 15]。本研究結(jié)果表明，腎I/R誘導(dǎo)GRP78、ATF-6、 p-eIF-2α、XPB-1水平升高。此外，通過定量CHOP水平來評(píng)估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)I/R后CHOP水平也增加了，而二甲雙胍能夠抵消以上ER應(yīng)激的上調(diào)。與此一致，研究表明二甲雙胍可降低小鼠肝組織中GRP78、IRE-1α表達(dá)，提示二甲雙胍可改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[16]。

自噬作用或稱細(xì)胞自消化，是基于雙膜泡(自噬體)的形成，它吞噬受損的成分并與溶酶體融合進(jìn)行降解。大量研究表明ER應(yīng)激激活自噬。Andriana等[17]研究表明,XPB-1和Ire1α的下游轉(zhuǎn)錄因子可通過轉(zhuǎn)錄激活Beclin-1誘導(dǎo)自噬作用，證實(shí)了本研究中XPB-1和 Beclin-1的高表達(dá)。同時(shí)，抑制PERK也顯著降低了c-myc誘導(dǎo)的人淋巴瘤細(xì)胞自噬作用[3]。本研究通過量化自噬體形成指標(biāo)Beclin-1和LAMP-2(自噬體-溶酶體融合所需的蛋白)來評(píng)估自噬的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)I/R后它們的水平顯著升高。此外，筆者的結(jié)果與Wu等[18]的研究結(jié)果一致，顯示缺血腎中Beclin-1和LAMP-2蛋白水平升高。既往研究表明ER應(yīng)激誘導(dǎo)自噬的保護(hù)作用[2]。然而，當(dāng)自噬作用過度時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)它是有害的，并促進(jìn)細(xì)胞死亡。此外，Ding等[19]研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬作用可抑制ER應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。而本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可顯著降低自噬的過度激活。

本研究也證實(shí)了二甲雙胍對(duì)炎癥過程的影響，二甲雙胍減少腎I/R后促炎細(xì)胞因子IL-1β、 IL-6、MCP-1的分泌。再灌注過程中，活化的浸潤(rùn)細(xì)胞進(jìn)入受損腎組織，釋放大量促炎細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在缺血再灌注2h后，促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和MCP-1的分泌處于低水平，但再灌注24h后顯著增加。炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在某種程度上可能有助于ER應(yīng)激通過炎性復(fù)合物NLRP3 刺激IL1-β釋放[20]。有報(bào)道稱CHOP與炎性反應(yīng)相關(guān)，故ER應(yīng)激可能會(huì)引發(fā)炎癥。反過來，炎癥導(dǎo)致ROS的過度產(chǎn)生，有研究表明，自噬通過促進(jìn)炎性復(fù)合物降解并通過自噬體隔離它們來抑制炎性反應(yīng)。

綜上所述，二甲雙胍能夠有效保護(hù)腎臟免受缺血再灌注(I/R)誘導(dǎo)的損害，其對(duì)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、ER應(yīng)激通路和自噬過程具有潛在作用。此外，二甲雙胍還具有抑制細(xì)胞炎性損傷的作用。