徐婭佳，王玉燕，葉榮

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

冠狀病毒(coronaviruses，CoV)是一類有包膜的正鏈RNA病毒，主要導(dǎo)致動(dòng)物消化道和呼吸道疾病。曾經(jīng)只有2種冠狀病毒可引起人類普通呼吸道感染[1]，然而，近20年來，新現(xiàn)冠狀病毒已2次引起嚴(yán)重呼吸道綜合征的世界性流行[2]。2019年12月，一種導(dǎo)致武漢傳染性肺炎暴發(fā)的新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)，與2003年在我國首先暴發(fā)流行的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)呈現(xiàn)不同的傳播與致病性[3-4]。冠狀病毒主要起源于野生動(dòng)物，一些動(dòng)物尤其是蝙蝠，成為冠狀病毒的主要宿主和傳播媒介[5]。冠狀病毒表面的棘突(spike, S)蛋白與病毒宿主變異密切相關(guān)，該跨膜糖蛋白為病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞所必需，具有結(jié)合受體和誘導(dǎo)膜融合的重要作用；同時(shí)也參與冠狀病毒的致病作用，且為病毒誘導(dǎo)中和抗體的主要抗原[6]。

鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)感染以小鼠為主的嚙齒動(dòng)物，主要引起消化系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，也是最為廣泛使用的乙型冠狀病毒分子生物學(xué)和致病性研究的模式病毒。鼠冠狀病毒(murine coronavirus)有多個(gè)分離株，不同毒株之間致病性存在差異，如MHV-3主要引起急性肝炎，MHV-JHM導(dǎo)致嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，而MHV-A59依賴不同感染途徑可引起溫和的肝損害或中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變[7]。致病性的差異與病毒蛋白及其引發(fā)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答有關(guān)，同時(shí)這些分離株的S蛋白在適應(yīng)宿主細(xì)胞過程中發(fā)生變異[8]。與鼠冠狀病毒的原型株MHV-4相比，MHV-3 S蛋白的氨基酸殘基不同，而MHV-JHM和MHV-A59除了殘基有變化外，在S1亞單位高變區(qū)(high variable region, HVR)還有多個(gè)殘基的缺失[8]。

近年來，隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的進(jìn)步，對多種冠狀病毒S蛋白的膜融合機(jī)制、受體結(jié)合及抗體中和作用有了更深入的了解[9-11]。鼠冠狀病毒S蛋白屬于Ⅰ型膜融合蛋白，受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptor binding domain，RBD)位于S1亞單位，膜融合核心元件位于S2亞單位[12-13]。大部分冠狀病毒的RBD位于S1的C端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain, CTD)，即結(jié)構(gòu)域B，而鼠冠狀病毒的RBD位于S1的N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain, NTD)，即結(jié)構(gòu)域A[14-15]。

本研究以pCAGGS為載體，構(gòu)建了不同缺失的S基因突變體，并在鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Neuro-2a成功表達(dá)；以不同方法處理的病毒顆粒作為抗原免疫小鼠，獲得了多種多克隆抗體，由此分析結(jié)構(gòu)域B對病毒感染及S蛋白導(dǎo)致的膜融合產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，結(jié)構(gòu)域B的部分缺失與S2缺失同樣嚴(yán)重?fù)p害S蛋白的細(xì)胞-細(xì)胞間膜融合，且結(jié)構(gòu)域B是S蛋白的主要抗原決定簇，誘導(dǎo)的抗體具有明顯的中和病毒感染及抑制S蛋白誘導(dǎo)膜融合的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒

小鼠腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Neuro-2a購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。小鼠肺上皮樣細(xì)胞系L2和鼠冠狀病毒MHV-A59由美國紐約州立衛(wèi)生署Masters教授惠贈(zèng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染

2種細(xì)胞用含10%胎牛血清( fetal calf serum, FBS)(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基(HyClone)放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱(MITRE 4000，CONTHEM公司)中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代用稀釋的0.25%胰酶消化，按1∶3～5面積比分瓶(T25或T75)或鋪碟(D60)，間隔48～72 h。病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)36～48 h至聚合度為60%～80%，吸去培養(yǎng)基，加入調(diào)整至1×105pfu/mL病毒懸液1.0 mL (D60或T25)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～2 h后吸去病毒液，加新鮮完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

含MHV-A59的野生型S基因質(zhì)粒(pCAGGs-SA59)由美國賓州大學(xué)醫(yī)學(xué)院Weiss教授惠贈(zèng)。缺失突變體(圖1和圖3)，按常規(guī)分子生物學(xué)方法，用限制性內(nèi)切酶消化和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)回補(bǔ)構(gòu)建，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10F′(天根生物)，目的克隆用PCR篩選并測序鑒定。引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成，PCR試劑盒購自ThermoFisher公司。

用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)粒通過中抽獲得(Qiagen)。Neuro-2a細(xì)胞鋪6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h至細(xì)胞聚合度70%左右，吸去培養(yǎng)液，加入1.8 ml Opti-MEM(Gibco)繼續(xù)培養(yǎng)2 h。取2.5～3 μg質(zhì)粒至100 μL Opti-MEM，另取5～10 μL脂質(zhì)體lipofectamin 2000(Invitrogen)至100 μL Opti-MEM，輕輕將兩者混合并室溫靜置5 min，滴加至6孔板中。細(xì)胞板置37 ℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h，更換為DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，并定時(shí)觀察、拍照和收集樣品。

1.4 病毒顆粒純化與滅活

鼠冠狀病毒顆粒純化采用2次PEG沉淀[16]，操作均在4 ℃無菌條件下進(jìn)行。取高滴度病毒貯存液(1×107～5×107pfu/mL)1 mL，感染T25 培養(yǎng)的Neuro-2a細(xì)胞1 h，加完全培養(yǎng)基4 mL后繼續(xù)培養(yǎng)48 h至細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)≥80%，收集5 mL培養(yǎng)上清液，離心除去細(xì)胞碎片，立即感染T75 培養(yǎng)的Neuro-2a細(xì)胞1 h，加無血清培養(yǎng)基20 mL，培養(yǎng)48 h后收集上清液。 合并的含病毒培養(yǎng)上清液通過 3 500 rpm離心15 min(Beckman Allegra X-12R，下同)，除去細(xì)胞碎片，收集上清液至無菌玻璃瓶，放置磁力攪拌器上，緩慢滴加1/3體積的0.85% NaCl配制的30% PEG8000(生工)，繼續(xù)攪拌2 h。8 000 rpm離心20 min，沉淀物用1/20體積的0.85% NaCl溶解，再次用PEG沉淀，溶于1/10體積的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中，分裝每管100 μL，保存于 -80 ℃冰箱備用。使用前取出至冰上融化，分別進(jìn)行滅活處理﹝紫外線照射10 min(CX-2000型UVP紫外交聯(lián)儀：距離25 cm、強(qiáng)度 7 500 uw/cm2)[17]；56 ℃水浴25 min；加入1/20體積的10%SDS(生工)，置37 ℃水浴15 min﹞，見圖2。

1.5 小鼠抗體制備

滅活和未滅活的病毒樣品用4倍體積的PBS稀釋，加等體積弗氏佐劑(Sigma)并用注射器反復(fù)抽吸使之乳化，然后腹腔注射免疫BALB/c SPF級小鼠(上海斯萊克公司)。第14天和第21天以相同的劑量病毒和途徑加強(qiáng)免疫，并于第18天和第24天每組選擇1只小鼠，眼眶后眥靜脈采血并分離血清，以熱滅活病毒樣品為抗原，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定抗體效價(jià)。效價(jià)達(dá)標(biāo)后，次日靜脈注射1/4劑量的無佐劑病毒樣品進(jìn)行一次沖擊免疫。3d后眼球放血，分離血清，分裝后加等量80%甘油，保存于 -80 ℃冰箱備用。

1.6 蛋白印跡試驗(yàn)

Bio-rad Mini蛋白電泳裝置按說明書組裝，取30%(29.2∶0.8)丙烯酰胺儲(chǔ)存液(生工)，分別配制10%～12%分離膠和5%濃縮膠，內(nèi)槽加Tris-Gly緩沖液。轉(zhuǎn)染或感染后的細(xì)胞(T25或D60)用5～8 mL冰冷PBS洗滌2次，加500 μL IPP緩沖液(Bio-rad)裂解5 min，離心收集上清液，加等量2×SDS-PAGE樣品緩沖液，95 ℃ 5 min變性處理，冷卻后離心取上清液，上樣8～16 μL/孔。外槽加Tris-Gly緩沖液，80 V恒壓電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后再行120 V恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。取出凝膠，用去離子水洗2次，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，與聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜制備轉(zhuǎn)膜夾心，低溫500 mA恒流轉(zhuǎn)移2 h。轉(zhuǎn)印膜用5%脫脂奶粉PBS室溫封閉30 min，再與5%脫脂奶粉PBS加Tween-20稀釋的抗體于4 ℃孵育過夜，然后加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，置室溫孵育2 h，充分洗滌后再用發(fā)光底物顯影并拍照(Tenon 4600)。

1.7 病毒中和實(shí)驗(yàn)

抗體及對照血清用完全培養(yǎng)基梯度稀釋后置96孔細(xì)胞板中，每孔50 μL，重復(fù)3～5孔。病毒用完全培養(yǎng)基稀釋至2×105pfu/mL，取50 μL加至稀釋好的抗體孔中，37 ℃中孵育30 min。然后轉(zhuǎn)移至聚合度達(dá)80%的單層小鼠L2細(xì)胞(提前24～36 h鋪在96孔細(xì)胞板)上，5% CO2、37 ℃中培養(yǎng)1 h后吸去混合液，加入200 μL 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)8 h。觀察CPE并收集上清液和細(xì)胞裂解液用于病毒噬斑實(shí)驗(yàn)和蛋白印跡試驗(yàn)?？贵w抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞膜融合試驗(yàn)如下：轉(zhuǎn)染小鼠Neuro-2a細(xì)胞6h后直接將梯度稀釋的抗體加至其培養(yǎng)基中，置37 ℃、5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，并定時(shí)觀察CPE和拍照，收集樣品。

1.8 病毒噬斑實(shí)驗(yàn)

小鼠L2細(xì)胞鋪至D60中，培養(yǎng)36～48 h，使其達(dá)80%～90%聚合度后備用。將病毒上清液用含2%血清的DMEM按10倍系列稀釋，取1 mL合適稀釋度病毒加至已吸去培養(yǎng)基的L2細(xì)胞。置37 ℃中感染1 h后吸去病毒液，加入7 mL 55 ℃溫育的瓊脂細(xì)胞培養(yǎng)液(0.95%瓊脂/5% FBS/DMEM)，室溫凝固后轉(zhuǎn)移至37 ℃、 5%CO2中繼續(xù)培養(yǎng)40 h，取出覆蓋3 mL 55 ℃溫育的含0.05%中性紅的瓊脂細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)在37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)6～8 h，計(jì)數(shù)噬斑數(shù)量并剔去瓊脂后拍照，然后測定病毒滴度。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)域B缺失使鼠冠狀病毒S蛋白不能誘導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間膜融合

鼠冠狀病毒MHV-A59 S蛋白包含 1 324 個(gè)氨基酸殘基，是典型的Ⅰ型膜蛋白，包括N端信號肽、C端跨膜區(qū)(TM)和胞內(nèi)區(qū)(圖1B)。其中間R717被蛋白酶切割為2個(gè)亞單位S1和S2，S1亞基分為結(jié)構(gòu)域A(S1-NTD)、結(jié)構(gòu)域 B(S1-CTD)、結(jié)構(gòu)域C和結(jié)構(gòu)域 D；S2膜外區(qū)包括多種α-螺旋結(jié)構(gòu)，如上游螺旋(UH)、融合肽(FP)、七聯(lián)子重復(fù)1(HR1)和2(HR2)及中央螺旋(CH)[9](圖1B)。另外，根據(jù)SARS-CoV S蛋白推測，在S2′位點(diǎn)切割，除去UH使FP暴露，這對MHV-A59 S蛋白完成膜融合作用也非常重要[18]。

MHV-A59野生型S蛋白插入真核表達(dá)載體pCAGGS(圖1A)轉(zhuǎn)染小鼠Neuro-2a細(xì)胞能導(dǎo)致膜融合產(chǎn)生明顯的CPE(圖1C)。與預(yù)期的一樣，當(dāng)S2亞單位N端(727～1 052 位氨基酸)部分缺失﹝包括UH、FP、HR1和CH(ΔS2)﹞時(shí)(圖1B)，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不發(fā)生膜融合，與空載體(pC)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞一樣，無CPE產(chǎn)生(圖1C)。令人意外的是S1結(jié)構(gòu)域B中間207個(gè)氨基酸殘基(376～583位氨基酸)缺失(ΔB)時(shí)(圖1B)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞也失去膜融合功能(圖1C)。鼠冠狀病毒S蛋白結(jié)構(gòu)域B與S1-CTD重合，包含HVR、MHV-A59 S蛋白，此區(qū)域比MHV-4(JHM-SD)缺失了52個(gè)氨基酸[8]，可能與鼠冠狀病毒的組織特異性致病作用及同次要的多糖受體結(jié)合相關(guān)。

A：The main components of eukaryotic expression vector pCAGGS. B：The domains and the deleted region of murine coronavirus S gene constructed in plasmid pCAGGS. C：Cytopathic effects (CPE) of mouse Neuro-2a cells transfected with empty vector pCAGGS (pC), S2 N-terminal region-deleted mutant (ΔS2), domain B central region-deleted mutant (ΔB) and wild-type (S) S protein. CPE was observed and microphotographed at 24h post transfection with 250x magnification.

圖1 結(jié)構(gòu)域B缺失對鼠冠狀病毒S蛋白導(dǎo)致的細(xì)胞-細(xì)胞間膜融合的影響

Fig.1 Domain B deletion impaired the cell-cell membrane fusion induced by murine coronavirus S protein

2.2 不同滅活處理的鼠冠狀病毒均誘導(dǎo)產(chǎn)生識(shí)別S蛋白結(jié)構(gòu)域B的抗體

為了研究鼠冠狀病毒S蛋白的抗原性，我們用紫外線照射(Uv)、加熱(Ht)和去污劑(Dt)殺毒3種方法處理MHV-A59病毒顆粒，并以室溫放置不作處理(No)的病毒顆粒作為對照。與弗氏佐劑混合后免疫BALB/c小鼠，制備相應(yīng)的多克隆抗體(圖2A)。ELISA顯示，3種方法處理的病毒均能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體，平均效價(jià)≥2×105；未滅活處理的病毒顆粒腹腔注射后導(dǎo)致絕大部分小鼠感染而死亡，唯一存活小鼠的抗體效價(jià)為1×105(圖2A)。

用4種抗體分別與鼠冠狀病毒感染的細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白印跡試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)未處理的病毒顆粒誘導(dǎo)的抗體(No-Ab)針對完整S蛋白有較強(qiáng)的反應(yīng)；SDS處理的病毒顆粒誘導(dǎo)的抗體(Dt-Ab)針對完整S蛋白和裂解的S1/S2亞單位均有較強(qiáng)的反應(yīng)(圖2B)；紫外線照射處理的病毒顆粒誘導(dǎo)的抗體(Uv-Ab)針對完整S蛋白和裂解的S1/S2亞單位均有較弱的反應(yīng)；而加熱處理的病毒顆粒誘導(dǎo)的抗體(Ht-Ab)針對完整S蛋白和裂解的S1/S2亞單位均有反應(yīng)(圖2B)。但是，4種抗體對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)S蛋白及其缺失突變體的細(xì)胞裂解液蛋白印跡試驗(yàn)反應(yīng)與對病毒感染細(xì)胞裂解液的反應(yīng)不一致，對野生型S蛋白反應(yīng)No-Ab和Uv-Ab較弱，Ht-Ab和Dt-Ab較強(qiáng)；對S2 N端缺失突變體(ΔS2)Ht-Ab反應(yīng)最強(qiáng)，而Uv-Ab、Dt-Ab依次減弱，No-Ab最弱；對結(jié)構(gòu)域B缺失突變體(ΔB)幾乎都沒有反應(yīng)(圖2B)。這些反應(yīng)的差異性可能與病毒表達(dá)的S蛋白和質(zhì)粒表達(dá)的蛋白在翻譯后修飾(如糖基化)存在差異有關(guān)，同時(shí)說明大部分抗體是針對S1亞單位，S2則呈現(xiàn)較弱的抗原性。

A：Four treatments to murine coronavirus as antigens for the production of murine antisera to S protein. B：Reactivity of four murine antisera to S protein in lysates of Neuro-2a cells infected with wild type murine coronavirus MHV-A59. C：Reactivity of four murine antisera to partial deleted and wild type S proteins in lysates of Neuro-2a cells transfected with vector pCAGGS (pC), S2 N-terminal region-deleted mutant (ΔS2), domain B central region-deleted mutant (ΔB) and wild-type (S) S protein respectively.

圖2 結(jié)構(gòu)域B是鼠冠狀病毒S蛋白的穩(wěn)定抗原決定簇

Fig.2 Domain B is a stable antigenic determinant of murine coronavirus S protein

2.3 結(jié)構(gòu)域B為鼠冠狀病毒S蛋白的優(yōu)勢抗原決定簇

為進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)構(gòu)域B與抗體的反應(yīng)性，我們進(jìn)一步構(gòu)建了3個(gè)新的S蛋白突變體(圖3A)。突變體RBD僅含MHV-A59 S蛋白N端，包括信號肽在內(nèi)的1～326位氨基酸(即完整的S1-NTD)，其余序列均缺失；突變體ΔA1和ΔA2缺失了結(jié)構(gòu)域A，即S1-NTD的C端部分及S2 N端的大部分序列，兩者的區(qū)別在于ΔA2除有完整的結(jié)構(gòu)域B外，還保留了與結(jié)構(gòu)域B的連接序列、完整序列的結(jié)構(gòu)域C和D及S1/S2切割位點(diǎn)(圖3A)。選擇與S2 N端缺失突變體(ΔS2)反應(yīng)最為強(qiáng)烈的Ht-Ab進(jìn)行蛋白印跡試驗(yàn)，結(jié)果顯示，Ht-Ab抗體不與RBD反應(yīng)，但與缺失突變體ΔA1和ΔA2反應(yīng)，與ΔB和ΔS2反應(yīng)與圖2C基本一致(圖3A)。加熱處理的病毒顆粒誘導(dǎo)的抗體(Ht-Ab)能與全長S蛋白及其含結(jié)構(gòu)域B的突變體產(chǎn)生特異性反應(yīng)，提示S1-CTD是S蛋白穩(wěn)定的優(yōu)勢抗原決定簇。

A：Three deleted mutants of murine coronavirus S gene constructed in eukaryotic expression vector pCAGGS: receptor binding domain mutant (RBD), domain A C D plus S2 N-terminal region-deleted mutant (ΔA1) and domain A plus S2 N-terminal region-deleted mutant (ΔA2). B：Reactivity of Ht antisera to most partially deleted S proteins in lysates of Neuro-2a cells transfected with three heavy deletion mutants (RBD, ΔA1 and ΔA2) and two control deletion mutants (ΔB and ΔS2, Fig 1B).

圖3 鼠冠狀病毒誘導(dǎo)的抗體特異性識(shí)別S蛋白B結(jié)構(gòu)域

Fig.3 Antibodies induced by heat-inactivated murine coronavirus (Ht) recognizes S domain B specifically

2.4 抗體對鼠冠狀病毒復(fù)制的抑制和S蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞間膜融合

前面結(jié)果顯示，鼠冠狀病毒顆粒誘導(dǎo)的S蛋白抗體主要是針對結(jié)構(gòu)域B而不是受體結(jié)合域(圖2、3)。為了分析這些抗體的中和作用，將不同稀釋度的Ht-Ab與2×105MHV-A59在37 ℃孵育30 min，然后感染小鼠L2細(xì)胞，同時(shí)用小鼠正常血清作為對照。對感染8 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行噬斑試驗(yàn)以檢測病毒復(fù)制水平。收集細(xì)胞裂解液，檢測病毒核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N蛋白)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，當(dāng)抗體稀釋度為1∶100和1∶500時(shí)能完全抑制病毒感染L2細(xì)胞(1.0 MOI)，而相同稀釋倍數(shù)的正常小鼠血清(對照樣本)不能抑制病毒感染；當(dāng)抗體稀釋度為1∶2 000 時(shí)仍能抑制大部分病毒的復(fù)制(圖4A、B)。

同樣，Ht-Ab對S蛋白介導(dǎo)小鼠細(xì)胞膜融合也有明顯的抑制作用。按脂質(zhì)體常規(guī)方法，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠Neuro-2細(xì)胞6 h后用含Ht-Ab的完全培養(yǎng)基(1∶500)替換，同時(shí)加等量正常小鼠血清作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察CPE。結(jié)果顯示，未加抗體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞融合，形成多核巨細(xì)胞(syncytia)病變，而加抗體培養(yǎng)的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞一樣，無CPE發(fā)生(圖4C)。這些結(jié)果說明，針對結(jié)構(gòu)域B的抗體不但能抑制鼠冠狀病毒感染同源細(xì)胞，也能特異性抑制S蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞間膜融合。

A：N protein expression in lysates of Neuro-2a cells infected by murine coronavirus which is incubated with normal mouse serum or antiseum (Ht-Ab). B：Plaque assay of supernants of Neuro-2a cells infected by murine coronavirus which is incubated with normal mouse serum or antiseum (Ht-Ab). C：Cytopathic effects (CPE) of Neuro-2a cells transfected wild-type S gene and cultured in media containing normal mouse serum or antiseum (Ht-Ab). CPE was observed and microphotographed at 24 h with 250x magnification.

圖4 鼠冠狀病毒S蛋白B結(jié)構(gòu)域的抗體能抑制病毒復(fù)制和細(xì)胞-細(xì)胞間膜融合

Fig.4 Antibody to murine coronavirus S protein domain B inhibits viral replication and the cell-cell membrane fusion

3 討論

Ⅰ型膜融合蛋白前體通常被蛋白酶切割為2個(gè)亞單位，并形成十分緊湊的三聚體，3個(gè)N端亞單位形成冠狀結(jié)構(gòu)，將3個(gè)C端亞單位包埋于內(nèi)部。病毒進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，N端亞單位首先與細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，使病毒與細(xì)胞靠近，變構(gòu)后暴露的C端亞單位融合肽插入細(xì)胞膜，然后HR1和HR2形成雙螺旋折疊，使脂質(zhì)膜完全融合[19]。鼠冠狀病毒的S蛋白最早被證明屬于Ⅰ型膜融合蛋白，其S2融合核心結(jié)構(gòu)很快得到解析[12-13]。鼠冠狀病毒S蛋白也能導(dǎo)致非受體依賴的細(xì)胞-細(xì)胞間膜融合，但需要包括RBD在內(nèi)的S1亞單位特定氨基酸殘基參與[20-21]。鼠冠狀病毒S1亞單位含結(jié)構(gòu)域A、B、C和D，其中結(jié)構(gòu)域A和B與受體結(jié)合相關(guān)的功能域S1-NTD和S1-CTD重疊[9](圖1)。冷凍電子顯微鏡顯示，MHV-A59 S蛋白胞外區(qū)三聚體與S1亞基呈“V”形結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域B比結(jié)構(gòu)域A呈現(xiàn)更突出的位置[9]。不管是S2融合核心區(qū)域缺失，還是結(jié)構(gòu)域B缺失，S蛋白導(dǎo)致的細(xì)胞-細(xì)胞間膜融合都會(huì)受損(圖1)，同時(shí)這2種缺失突變也導(dǎo)致S蛋白不能被切割成獨(dú)立的亞單位(圖2、3)。說明S1和S2的完整結(jié)構(gòu)對其膜融合功能均很重要，也提示S蛋白切割可能發(fā)生在膜結(jié)合空間結(jié)構(gòu)形成甚至膜融合發(fā)生過程中。

大部分冠狀病毒S1-NTD結(jié)合糖類受體，S1-CTD結(jié)合蛋白類受體，但鼠冠狀病毒則通過S1-NTD識(shí)別蛋白質(zhì)受體mCEACAM1a[22]。甲型冠狀病毒1群S蛋白可結(jié)合同源宿主動(dòng)物受體蛋白APN，其RBD位于S1-CTD，而S1-NTD則與唾液酸結(jié)合[23]；乙型牛冠狀病毒S蛋白的RBD還含有類lectin結(jié)構(gòu)域[24]。人冠狀病毒HCoV-N63和SARS-CoV的RBD位于S1-CTD 結(jié)合受體ACE2[25-26]。最近出現(xiàn)的2019-nCoV也能結(jié)合ACE2，但位點(diǎn)略有不同，而且識(shí)別SARS-CoV S蛋白的抗體也能中和兩者的結(jié)合[27-28]。因此，S蛋白結(jié)合主要蛋白受體時(shí)，結(jié)合細(xì)胞表面多糖是冠狀病毒感染的重要因素[14]。早期對鼠冠狀病毒不同型別致病性的研究發(fā)現(xiàn)，位于結(jié)構(gòu)域B高變區(qū)的氨基酸突變和缺失是其對肝組織和神經(jīng)系統(tǒng)致病性產(chǎn)生差異的重要原因[7-8]。因此，這一區(qū)域的人工缺失導(dǎo)致S蛋白與多糖或蛋白輔助受體結(jié)合的潛在能力受損，可能是導(dǎo)致細(xì)胞-細(xì)胞間膜融合能力丟失原因(圖1)。

實(shí)驗(yàn)中把2次PEG沉淀純化的鼠冠狀病毒顆粒直接腹腔注射小鼠，出現(xiàn)75%以上的致死率；而用紫外線照射、加熱滅活及去污劑處理的樣品注射則不發(fā)生死亡。PEG沉淀對病毒感染性影響較小，說明病毒顆粒仍保持較完整的結(jié)構(gòu)，3種處理方式對病毒結(jié)構(gòu)的破壞程度依次增加(圖2A)。用這些病毒樣品誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體的反應(yīng)性有明顯的差異(圖2B、C)：①完整病毒誘導(dǎo)的抗體(No-Ab)主要針對病毒表達(dá)的S蛋白前體，而對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)的S蛋白反應(yīng)較弱；②用SDS處理的病毒樣品誘導(dǎo)的抗體(Dt-Ab)對病毒表達(dá)S蛋白、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)S蛋白前體及裂解S1/S2的反應(yīng)均較強(qiáng)，而且也能很好地誘導(dǎo)針對N蛋白的抗體[16]；③加熱處理比紫外線照射誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)更強(qiáng)；④所有的抗體對S2缺失突變體(ΔS2)均有反應(yīng)，而對結(jié)構(gòu)域B缺失突變體(ΔB)均無反應(yīng)或反應(yīng)較弱(圖2C，圖3)。根據(jù)這些結(jié)果推測，一是天然病毒感染表達(dá)的S蛋白與用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的S蛋白可能在翻譯后的修飾上存在差異(如糖基化)；二是結(jié)構(gòu)域B具有明顯的抗原優(yōu)勢，而S2的抗原性明顯較弱，可能與S1-CTD的N糖基化位點(diǎn)有關(guān)[29]。

冠狀病毒的中和抗體主要由S蛋白誘導(dǎo)，大部分集中在S1亞單位[30]。為了驗(yàn)證結(jié)構(gòu)域B在病毒感染中的作用，選用能特異性識(shí)別結(jié)構(gòu)域B的熱滅活病毒顆粒誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體(圖3)進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該抗體不但能抑制鼠冠狀病毒感染鼠L2細(xì)胞，而且能抑制S基因轉(zhuǎn)染的鼠Neuro-2a細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞-細(xì)胞間膜融合，抗體效價(jià)在1×103以上(圖4)。這一結(jié)果說明結(jié)構(gòu)域B可能在病毒入胞、致CPE、顆粒裝配及釋放等步驟發(fā)揮重要作用。因此，在乙型冠狀病毒包括最新出現(xiàn)的2019-nCoV中，非受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域A是否具有類似的功能有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)闡明。

綜上所述，根據(jù)冷凍電子顯微鏡解析的MHV-A59 S蛋白三聚體膜外區(qū)結(jié)構(gòu)信息，結(jié)構(gòu)域B占據(jù)位于中間位置且突出(圖5)。推測結(jié)構(gòu)域B的位置和糖基化優(yōu)勢使其易于激活抗原呈遞細(xì)胞而成為優(yōu)勢抗原決定簇。另外，結(jié)構(gòu)域B發(fā)生缺失或者與抗體結(jié)合將導(dǎo)致S1亞單位的結(jié)構(gòu)域A空間位置變化，從而影響其RBD與受體的結(jié)合；這種空間位置變化還可通過結(jié)構(gòu)域C和D傳遞給兩個(gè)切割位點(diǎn)(S1/S2和S2′)使切割效率下降或喪失(圖5)。

A spatial hindrance is induced by deletion or antibody binding of domain B：Conformation change of S1 subunit would interfere the binding of domain A (RBD) to receptor mCEACAM1a, or/and S1 subunit production or fusion peptide exposure by covering S1/S2 or S2′ cleavage site. Domain B shields domain A to maintain the receptor binding function：In a stable S trimer structure of murine coronavirus domain B is protruded over other domains and make it possess a spatial priority being recognized by immune cells.

圖5 結(jié)構(gòu)域B影響鼠冠狀病毒S蛋白作用的假說

Fig.5 A hypothesis for effects of S1 subunit domain B on the function of murine coronavirus S protein