陸小琴，杜 銳，趙玉強，牛司強

(1.雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與檢驗學(xué)院，四川 雅安 625000； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，重慶 400016)

分化抑制因子1 (inhibitor of differentiation 1, Id1)是一種螺旋-環(huán)-螺旋狀結(jié)構(gòu)的負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控蛋白[1]。Id1可抑制轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活能力，參與調(diào)節(jié)細胞生長和分化[2-4]。Id1的表達與乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV)相關(guān)性肝細胞癌的預(yù)后密切相關(guān)[5]，如Ding等[6]人對96例HBV相關(guān)性肝細胞癌的組織樣本進行分析發(fā)現(xiàn)，64.6%的樣本顯示Id1過表達，與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而且Id1過表達患者的生存率較低。但是，Id1在HBV相關(guān)性肝細胞癌中的作用機制仍缺乏報道，因此本文旨在探討Id1在HBV復(fù)制、肝癌細胞增殖和凋亡中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

HepG2.2.15肝癌細胞株(批號：ZQ0551)購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

MTT、細胞凋亡檢測試劑盒(批號：ST316、C1062S)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(批號：D6110 A、DRR820 A)購自日本Takara公司；pGEx-4T-1質(zhì)粒(批號：CW2198)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TRIzol、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染液(批號：15596018、11668019)購自美國Invitrogen公司；胎牛血清、青鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基(批號：16250086、15140163、11965092)購自美國Gibco公司；G418(批號：G8160)購自北京索萊寶科技有限公司；Pifithrin-α(批號：P4359)購自美國Sigma公司；HBsAg和HBeAg ELISA試劑盒(批號：227712、227699)購自武漢艾美捷科技有限公司；抗Id1抗體(批號：MAB4372)購自美國Chemicon公司；抗HBx抗體、抗Bax抗體、抗BcL-2抗體、抗Cleaved caspase-3抗體、抗GAPDH抗體(批號：ab39716、ab32503、ab32124、ab2302、ab181602)購自英國Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建與細胞轉(zhuǎn)染

參照于游等[7]的報道設(shè)計Id1的干擾序列(siRNA-Id1)和無關(guān)序列 (siRNA-Control)(見表1)。使用基因工程的方法將干擾序列和無關(guān)序列構(gòu)建至pGEx-4T-1質(zhì)粒中。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染液將siRNA-Id1質(zhì)粒和siRNA-Control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2.2.15肝癌細胞株，使用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(Western blot)驗證Id1 mRNA和蛋白質(zhì)表達量的抑制效果。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與分組

使用含10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素和400 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2.2.15肝癌細胞。將細胞隨機分為4組：對照組(Control group)、siRNA-Control組(siRNA-Control group)、siRNA-Id1組(siRNA-Id1 group)、siRNA-Id1+Pifithrin-α組(siRNA-Id1+Pifithrin-α group)。對照組細胞不進行細胞轉(zhuǎn)染，siRNA-Control組細胞使用siRNA-Control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，siRNA-Id1組細胞使用siRNA-Id1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，siRNA-Id1+Pifithrin-α組細胞使用siRNA-Id1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后加入終濃度為20 μmol/L的Pifithrin-α[8]。孵育48 h后，收集細胞和上清液進行檢測。

1.3.3 qRT-PCR

TRIzol試劑盒提取HepG2.2.15細胞中的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR試劑盒檢測Id1和HBx基因的表達，引物序列(見表2)。目的基因的相對表達量=(實驗組的2-ΔCt)/(對照組的2-ΔCt)(ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)[9]。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

ELISA試劑盒檢測細胞上清液中HBsAg和HBeAg的含量，酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度值(Optical Density, OD)。

1.3.5 Western blot

細胞裂解后，12000 r/min離心10 min，取上清進行蛋白定量，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，使用抗Id1抗體 (1∶500)、抗HBx抗體 (1∶1000)、抗Bax抗體 (1∶1000)、抗BcL-2抗體 (1∶1000)、抗Cleaved caspase-3抗體 (1∶1000)、抗GAPDH抗體 (1∶5000)，4℃過夜孵育。洗滌后，加入二抗孵育1 h，洗滌后顯色，曝光和拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測定灰度值，對照組中目的條帶和GAPDH條帶的灰度值之比作為1[10]。

1.3.6 MTT試驗

將5×103個細胞種植于96孔板，于培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后加入10 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，加入100 μL的DMSO溶液，室溫下振蕩混勻5 min，酶標(biāo)儀在490 nm下測定OD值。

1.3.7 流式細胞術(shù)

向105個細胞中加入195 μL的AnnexinⅤ-FITC結(jié)合液重懸，加入5 μL的AnnexinⅤ-FITC和10 μL的碘化丙啶，混勻后孵育20 min，流式細胞儀檢測。Annexin Ⅴ+PI-細胞為早期凋亡細胞，Annexin Ⅴ+PI+細胞為晚期凋亡細胞，凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 siRNA-Id1抑制Id1的表達

siRNA-Id1組細胞中Id1 mRNA和蛋白的表達量低于siRNA-Control組(P<0.05)(見圖1和表3)。

2.2 siRNA-Id1抑制HBx的表達

與siRNA-Control組相比較，siRNA-Id1組細胞中HBx mRNA和蛋白的表達量降低(P<0.05)；與siRNA-Id1組相比較，siRNA-Id1+Pifithrin-α group組細胞中HBx mRNA和蛋白的表達量升高(P<0.05)(見圖2和表4)。

表1 siRNA序列

表2 引物序列

2.3 siRNA-Id1抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制

與siRNA-Control組相比較，siRNA-Id1組細胞上清液中HBsAg和HBeAg的含量降低(P<0.05)；與siRNA-Id1組相比較，siRNA-Id1+Pifithrin-α group組細胞上清液中HBsAg和HBeAg的含量升高(P<0.05)(見表5)。

2.4 siRNA-Id1抑制HepG2.2.15肝癌細胞的增殖

與siRNA-Control組相比較，siRNA-Id1組細胞在培養(yǎng)48 h和72 h時的OD值降低(P<0.05)；與siRNA-Id1組相比較，siRNA-Id1+Pifithrin-α group組細胞在培養(yǎng)48 h和72 h時的OD值升高(P<0.05)(見表6)。

注：1：siRNA-Control組；2：siRNA-Id1組。圖1 Western blot檢測細胞中Id1蛋白的表達Note. 1, siRNA-Control group; 2, siRNA-Id1 group.Figure 1 Western blot was used to examine the protein expression of Id1

表3 Id1表達的比較(n=10)

注：1：Control組；2：siRNA-Control組；3：siRNA-Id1組；4：siRNA-Id1+Pifithrin-α組。圖2 Western blot檢測HBx蛋白的表達Note. 1, Control group; 2, siRNA-Control group; 3, siRNA-Id1 group; 4, siRNA-Id1+Pifithrin-α group.Figure 2 Western blot was used to examine the protein expression of HBx

表4 4組細胞中HBx表達的比較(n=10)

注：與Control組相比，*P<0.05；與siRNA-Control組相比，#P<0.05；與siRNA-Id1組相比，▲P<0.05。

Note. Compared with Control group,*P<0.05. Compared with siRNA-Control group,#P<0.05. Compared with siRNA-Id1 group,▲P<0.05.

表5 細胞上清液中HBsAg和HBeAg水平的比較(n=10)

注：與Control組相比，*P<0.05；與siRNA-Control組相比，#P<0.05；與siRNA-Id1組相比,▲P<0.05。

Note. Compared with Control group,*P<0.05. Compared with siRNA-Control group,#P<0.05. Compared with siRNA-Id1 group,▲P<0.05.

2.5 siRNA-Id1誘導(dǎo)HepG2.2.15肝癌細胞的凋亡

與siRNA-Control組相比較，siRNA-Id1組細胞的早期細胞凋亡比例和晚期細胞凋亡比例升高(P<0.05)；Pifithrin-α可抑制Id1基因沉默后的促凋亡效應(yīng)(P<0.05)(見圖3和表7)。

2.6 siRNA-Id1對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

與siRNA-Control組相比較，siRNA-Id1組細胞中Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達量升高，而BcL-2蛋白的表達量降低(P<0.05)；Pifithrin-α可部分抑制Id1基因沉默后的生物學(xué)效應(yīng)(P<0.05)(見圖4和表8)。

表6 4組細胞增殖的比較(n=10)

注：與Control組相比，*P<0.05；與siRNA-Control組相比，#P<0.05；與siRNA-Id1組相比，▲P<0.05。

Note. Compared with Control group,*P<0.05. Compared with siRNA-Control group,#P<0.05. Compared with siRNA-Id1 group,▲P<0.05.

圖3 流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡Figure 3 Flow cytometry was used to examine cell apoptosis

表7 4組細胞凋亡率的比較(n=10)

注：與Control組相比，*P<0.05；與siRNA-Control組相比，#P<0.05；與siRNA-Id1組相比，▲P<0.05。

Note. Compared with Control group,*P<0.05. Compared with siRNA-Control group,#P<0.05. Compared with siRNA-Id1 group,▲P<0.05.

表8 細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的比較(n=10)

注：與Control組相比，*P<0.05；與siRNA-Control組相比，#P<0.05；與siRNA-Id1組相比，▲P<0.05。

Note. Compared with Control group,*P<0.05. Compared with siRNA-Control group,#P<0.05. Compared with siRNA-Id1 group,▲P<0.05.

注：1：Control組；2：siRNA-Control組；3：siRNA-Id1組；4：siRNA-Id1+Pifithrin-α組。圖4 Western blot檢測細胞中Bax、BcL-2、Cleaved caspase-3蛋白的表達Note. 1, Control group; 2, siRNA-Control group; 3, siRNA-Id1 group; 4, siRNA-Id1+Pifithrin-α group.Figure 4 Western blot was used to examine the protein expression of Bax, BcL-2, Cleaved caspase-3

3 結(jié)論

Id1是一種DNA結(jié)合抑制因子，可與堿性HLH家族成員形成異二聚體，抑制轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活能力[1]。Id1的過表達會導(dǎo)致肝細胞癌預(yù)后不良，如鄧宏宇等[11]發(fā)現(xiàn)Id1在肝細胞肝癌組織標(biāo)本中表達升高，而且其表達水平與患者的生存時間負(fù)相關(guān)。盡管已有研究表明Id1可能參與肝癌細胞的病理進展，但是Id1對肝癌細胞增殖、凋亡等生物學(xué)功能的影響仍缺乏相關(guān)證據(jù)，其作用機制尚不清楚，尤其是在HBV相關(guān)性肝細胞癌。

HBx蛋白可調(diào)節(jié)蛋白酶活性、胞漿鈣離子信號通路等功能，在促進HBV的有效復(fù)制中發(fā)揮重要作用，如Keasler等[12]發(fā)現(xiàn)在缺乏HBx蛋白的情況下，HBV在HepG2肝癌細胞中的復(fù)制水平降低了65%，而且該研究結(jié)論在小鼠模型中也得到了證實。此外，Ding等[6]人發(fā)現(xiàn)Id1與HBx的表達量呈正相關(guān)，雙重免疫熒光染色證實Id1與HBx在HBV相關(guān)性肝細胞癌組織中共表達，而且HBx可以促進HepG2肝癌細胞表達Id1 mRNA和蛋白。本文結(jié)果顯示，Id1沉默后HBx mRNA和蛋白的表達量均顯著下降，表明Id1不僅受到HBx的調(diào)節(jié)，還可以反過來調(diào)節(jié)HBx的表達。HBsAg和HBeAg是評價HBV復(fù)制的重要指標(biāo)，本文也發(fā)現(xiàn)Id1沉默后的HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的含量低于轉(zhuǎn)染對照組。以上結(jié)果表明，抑制Id1的表達可以下調(diào)HBx的表達和降低乙型肝炎病毒的復(fù)制。

為了進一步探討Id1對HBV相關(guān)性肝癌細胞增殖和凋亡的影響，本文分別對各組HepG2.2.15細胞進行了MTT試驗和AnnexinⅤ-FITC標(biāo)記，結(jié)果顯示Id1沉默后細胞的增殖受到抑制，而且早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞比例均顯著升高。此外，與siRNA-Control組相比較，siRNA-Id1組細胞中Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達量升高，而BcL-2蛋白的表達量降低，表明Id1沉默導(dǎo)致的促凋亡效應(yīng)可能與線粒體凋亡信號通路的激活有關(guān)。

p53基因是一種抑癌基因，其缺失和變異在一系列腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。p53也在HBV相關(guān)性肝細胞癌中發(fā)揮重要的病理作用，如Liu等[13]發(fā)現(xiàn)p53表達的缺失可激活HGF/c-Met信號通路，導(dǎo)致肝細胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強。此外，Yu等[14]發(fā)現(xiàn)Id1可以促進p53蛋白的降解，與上調(diào)MDM2癌基因的表達有關(guān)。根據(jù)以上研究結(jié)論，本文推測Id1對HBV復(fù)制、肝癌細胞增殖和凋亡的影響是否與Id1沉默導(dǎo)致p53過表達有關(guān)。因此，本文將一種常用的p53抑制劑Pifithrin-α添加至Id1沉默的HepG2.2.15細胞中，結(jié)果顯示Pifithrin-α可不同程度的抑制siRNA-Id1對HBV復(fù)制和細胞增殖的抑制效應(yīng)以及細胞凋亡的促進效應(yīng)，表明Id1可能通過調(diào)節(jié)p53參與上述生物學(xué)效應(yīng)。

綜上所述，Id1的特異性小分子干擾RNA可以降低乙型肝炎病毒的復(fù)制，抑制肝癌細胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡，其機制可能與p53的過表達有關(guān)。