邢 超 孫養(yǎng)鵬 張志光

顳下頜關(guān)節(jié)盤穿孔是臨床常見的一類疾病，其臨床主要表現(xiàn)為：張口受限、咬物痛、關(guān)節(jié)區(qū)彈響等，嚴重影響人們的生活。顳下頜關(guān)節(jié)盤是一種無血管的組織，其再生自我修復能力有限。目前對其治療主要有局部理療、熱敷，藥物治療，咬合治療，關(guān)節(jié)灌洗以及關(guān)節(jié)調(diào)壓治療。當保守治療無效時，排除手術(shù)禁忌癥后可手術(shù)切除關(guān)節(jié)盤或行關(guān)節(jié)盤復位修補術(shù)[1-3]。但是手術(shù)治療與保守治療的長期觀察并未有明顯的差異，臨床會看到有些關(guān)節(jié)盤穿孔的患者通過保守治療幾年后復診，關(guān)節(jié)盤穿孔部位出現(xiàn)修復愈合。Koyama[4]等人首次在顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病患者的滑液中發(fā)現(xiàn)多潛能間充質(zhì)細胞，體外實驗研究表明，這類細胞可分化為軟骨、骨、脂肪、神經(jīng)組織。為了研究顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細胞(synovial fluid-derived mesenchymal stem cells,SFMSCs)在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的作用，我們引入條件培養(yǎng)基來觀察人滑液來源的間充質(zhì)干細胞與大鼠關(guān)節(jié)盤軟骨細胞的相互作用，通過檢測大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細胞生長、增殖以及特定的基因表達水平，初步探索這類細胞在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的作用。

1.材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 實驗用SPF 級健康、雄性SD 大鼠，100g 左右,實驗動物由中山大學北校區(qū)動物中心提供，許可證號SCXK(粵)2011-0029，動物實驗方法符合動物倫理學要求。低糖型DMEM、胎牛血清、PBS(Hyclone)，a-MEM、0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 購自Gibico 公司，Anti-Collagen Type I Rabbit pAb 購于Calbiochem R○公司，Triton X-100、Anti-Collagen II,N-Terminal antibody produced in rabbit 從SIGMA-ALDRICHTM 公司購買，DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit gG(H+L)(EARTHoX.LLC·San Francaco CA·USA)，小牛血清、DEPC 水(MP Biomedicals)，DAPI(Cell Signaling)，CCK 試劑盒(泛博生化)，細胞周期分析試劑盒(聯(lián)科生物Multisciences)，TRIzol R○Reagent(Ambion,Life Technologies)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)，LightCycler R○480 SYBR Green Master(Roche)。

1.2 細胞培養(yǎng)與擴增

(1)人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細胞獲取：中山大學光華口腔醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院顳下頜關(guān)節(jié)病診治中心就診患者，實驗前患者簽署知情同意書，該項目獲得中山大學光華口腔醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準。對需做造影檢查的顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病患者，8 號注射器關(guān)節(jié)上腔局部麻醉的同時注入1.5～2.0ml 利多卡因行關(guān)節(jié)上腔灌洗，收集注射器中的滑液[4]，300g/min 離心8min,加入含10%FBS 的alpha-MEM 轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中，48h 換液，利用干細胞的貼壁特性，分離提純。大約2 周后細胞長滿80%，1∶3 傳代，成脂、成骨、成軟骨確認其多向分化能力。

(2)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細胞獲取：取SPF級SD 大鼠，無菌條件下依次解剖周圍皮膚、肌肉組織，血管鉗離斷分離下頜升支將髁突及其附著物取出，轉(zhuǎn)移至超凈臺中。剝離周圍附著肌肉，分離去凈關(guān)節(jié)盤周邊附著的滑膜組織。用眼科剪將分離出的關(guān)節(jié)盤剪至1mm3大小，放入乘有質(zhì)量濃度為0.2%的I 型膠原酶的培養(yǎng)瓶中消化4h，離心棄上清液，PBS 沖洗再次離心棄上清液，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中使用含10%FBS 的低糖型-DMEM 培養(yǎng)(L-DMEM)，3～4 天換液，待細胞長滿培養(yǎng)瓶80%后傳代[5]。

1.3 免疫熒光染色 取大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨P1 代細胞，按5×103/皿，接種至激光共聚焦皿中，培養(yǎng)24h 待細胞貼壁后，PBS 輕輕沖洗，4%多聚甲醛-20℃下固定30min，PBS 沖洗干凈加入0.3%Triton X-100 常溫下透膜15min,PBS 洗凈5%小牛血清(BSA)37℃封閉2h，I 型膠原抗體(1∶40)、II 型膠原抗體(1∶200)稀釋相應倍數(shù)4℃過夜(＞16h)孵育一抗，37℃下孵育二抗1h，DAPI常溫染色5min，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及I 型膠原、II 型膠原熒光表達。

1.4 條件培養(yǎng)基制備 取P3 代SFMSCs 接種至75cm2培養(yǎng)瓶，待細胞長至70%體積時換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 小時后，收集上清液，700g 離心8min 去除細胞碎片，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ〗鈨龅纳锨逡喊凑?∶2 體積比加入含10%FBS 新鮮的L-DMEM，制備條件培養(yǎng)基(SFMSC-CM)。

1.5 CCK-8 檢測細胞生長情況 取P1 代大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細胞，按照3×103/孔接種至96 孔板，每組設(shè)置3 個復孔平行對照。大約6h 后細胞貼壁，輕輕的吸掉原有的培養(yǎng)基。實驗組換用SFMSC-CM 每隔兩天換液，對照組使用含10%FBS 的L-DMEM 每隔三天換液。分別于0、1、2、3 天避光條件下加入CCK-8 試劑，根據(jù)預實驗摸索條件，1h 后酶標儀450nm 波長下檢測吸光度(OD)值。

1.6 RT-PCR 檢測相關(guān)基因表達情況 取P1代大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細胞，按照2×105密度接種至25cm2培養(yǎng)瓶中，每組設(shè)置3 個復孔平行對照。實驗組加入SFMSC-CM 每隔2 天換液，對照組加入含10%FBS 的L-DMEM 每隔3 天換液。分別于7、14 天后收集樣本，使用TRIzol?提取RNA。提取的樣品測定濃度后，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系如下所示：取500ngRNA 樣品1ul Oligo(dT18)primer，加入DEPC 水至12ul，65℃孵育5min 冰上冷卻。依次加入4ul 5X Reaction Buffer、1ul RiboLock Rnase Inhibitor、2ul dNTP Mix、1ul RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase。42℃孵育60min，70℃孵育5min 終止反應。使用SYBR?Green QPCR Master Mix 試劑，在LightCycler?480(Roche)進行定量RT-PCR(qRT-PCR)。熒光定量PCR 反應體系如下：2ul DNA 樣品加入正反向引物各1ul，DEPC 水6ul，SYBR 10ul。反應過程如下:95℃5min 前期孵育，95℃10s、60℃20s、72℃30s 擴增45 個循環(huán)，95℃5s、65℃1min、97℃持續(xù)，40℃30s 冷卻。按照K.J.Livak 等人[6]的方法計算與對照組相對CT 值(2-△△CT)作為基因水平表達的改變。采用GAPDH 作為管家基因，分析I 型膠原、II 型膠原、X 型膠原基因表達情況，上述基因引物合成如表1 所示，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

圖1 人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細胞形態(tài)觀察及多向分化

表1 RT-PCR引物合成序列

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用t 檢驗，P＜0.05為差異具有顯著性。

2.結(jié)果

2.1 人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細胞形態(tài)學觀察和三向誘導分化 如圖1 所示：人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細胞(SFMSCs)顯微鏡下呈現(xiàn)纖維樣形態(tài)(圖1A)；人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化，Von Kossa's 礦化結(jié)節(jié)染色(圖1B)；人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細胞軟骨誘導分化，軟骨塊切片II 型膠原染色(圖1C)；人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細胞成脂誘導分化，脂滴蘇丹黑染色(圖1D)。

2.2 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細胞I 型、II 型膠原激光共聚焦顯微鏡觀察 如圖2 所示，激光共聚焦顯微鏡下可看的細胞胞漿內(nèi)均有I 型、II 型膠原呈現(xiàn)綠色熒光表達，藍色熒光為DAPI 核染色。激光共聚焦顯微鏡下I 型膠原、II 型膠原均有表達，驗證獲取的細胞為大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細胞。

圖2 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨I、II 型膠原免疫熒光染色

圖3 CCK-8 檢測大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細胞0，24h，48h，72h 吸光度值

2.3 CCK-8 細胞增殖實驗 如圖3 所示，0，24h 時細胞吸光度值(OD 值)基本一致，表明細胞的增殖沒有出現(xiàn)明顯差異，48h，72h 實驗組吸光度值明顯高于對照組，P＜0.001 差異具有統(tǒng)計學意義，表明條件培養(yǎng)基組細胞增殖速度明顯高于對照組。

2.4 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細胞相關(guān)基因表達水平的變化 如圖4 所示，第7 天，與對照組相比實驗組中Col I 型膠原mRNA 的含量表達明顯增加(圖4A)，Col X 型膠原mRNA 的含量表達在實驗組中出現(xiàn)明顯降低(圖4C)；第14 天，與對照組相比Col I 型膠原mRNA 含量在實驗組中出現(xiàn)明顯降低(圖4A)，Col II 型膠原mRNA 含量在實驗組中明顯增加(圖4B)，Col X 型膠原mRNA 的含量表達在實驗組中出現(xiàn)明顯降低(圖4C)。

圖4 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細胞相關(guān)基因表達水平

3.討論

對于關(guān)節(jié)盤的病變，Lanze 在1909 年首次報道摘除關(guān)節(jié)盤治療TMD，但摘除關(guān)節(jié)盤后的髁突骨質(zhì)可發(fā)生退行性改變，例如：骨摩擦音、關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)吸收甚至出現(xiàn)纖維性關(guān)節(jié)強直。70 年代關(guān)節(jié)造影術(shù)的出現(xiàn)，明確證實了關(guān)節(jié)盤移位、穿孔的存在。隨后，McCarty 對327 例關(guān)節(jié)盤移位穿孔修復術(shù)2 年追蹤復查，成功率達到94%，開創(chuàng)了關(guān)節(jié)復位和修補術(shù)外科。但是關(guān)節(jié)盤穿孔手術(shù)治療與保守治療長期效果追蹤并沒有顯示出明顯的優(yōu)勢[7]。

間充質(zhì)干細胞除了骨髓來源外，還存在于體內(nèi)多種組織中比如：牙髓、牙周膜、顳下頜關(guān)節(jié)滑液等。臨床及動物實驗模型觀察到這些細胞在損傷愈合中發(fā)揮重要的作用，它們不僅可以通過分化成不同的細胞調(diào)節(jié)修復進程，也可以通過與多種組織和細胞(纖維細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞)相互作用提供組織組織再生和損傷修復的內(nèi)環(huán)境[8]。有研究表明關(guān)節(jié)內(nèi)出血、炎癥、韌帶斷裂、關(guān)節(jié)盤穿孔可能會增加滑液中的干細胞數(shù)量[4,9]，但是對這類細胞在關(guān)節(jié)內(nèi)的具體作用還不清楚。我們使用顳下頜關(guān)節(jié)滑液間充質(zhì)干細胞制作條件培養(yǎng)基，CCK-8 細胞增殖實驗表明SFMSC-CM 促進關(guān)節(jié)盤軟骨細胞的增殖，該結(jié)果與之前在機體的其他器官例(腦、心臟、腎臟)[10]一致。

I 型膠原和II 型膠原是關(guān)節(jié)盤軟骨細胞中常見的兩種膠原，對于它們之間的含量變化，目前還沒有得出明確的結(jié)論，一般認為I 型膠原的增加可能與軟骨去分化有關(guān)[11]。通過RT-PCR 檢測軟骨相關(guān)基因的表達水平發(fā)現(xiàn)，I 型膠原在第7 天時實驗組的表達量比對照組增加，然而14 天后對照組的表達量高于實驗組。II 型膠原在第7 天時兩組沒有明顯差異，第14 天后實驗組表達量高于對照組。我們認為第7 天I 型膠原實驗組含量的增加其原因可能是可能是細胞的增殖速度增加，軟骨細胞出現(xiàn)去分化現(xiàn)象。第14 天時由于培養(yǎng)瓶的體積有限，細胞生長受到限制，細胞不再增殖，然而SFMSCCM 可能抑制軟骨細胞去分化，因而出現(xiàn)I 型膠原表達量下降的現(xiàn)象，II 型膠原實驗組的含量高于對照組。X 型膠原一般認為是細胞肥大的標識[11]，我們的實驗觀察第7 天、14 天時實驗組含量均明顯低于對照組，表明SFMSC-CM 通過抑制軟骨細胞的X 型膠原表達，發(fā)揮抑制細胞肥大作用。

我們的實驗通過體外條件培養(yǎng)基模擬顳下頜關(guān)節(jié)滑液中的干細胞分泌物，發(fā)現(xiàn)這些分泌物對關(guān)節(jié)盤軟骨細胞具有促進增殖，RT-PCR 檢測相關(guān)基因顯示可以維持軟骨細胞表型，抑制肥大。今后我們將進一步明確分泌物的作用通路及干細胞的遷移機制促使更多的干細胞參與關(guān)節(jié)盤穿孔的修復，為關(guān)節(jié)盤穿孔提供新的治療方法。