邢 超 孫養(yǎng)鵬 張志光

顳下頜關(guān)節(jié)盤穿孔是臨床常見的一類疾病，其臨床主要表現(xiàn)為：張口受限、咬物痛、關(guān)節(jié)區(qū)彈響等，嚴(yán)重影響人們的生活。顳下頜關(guān)節(jié)盤是一種無血管的組織，其再生自我修復(fù)能力有限。目前對(duì)其治療主要有局部理療、熱敷，藥物治療，咬合治療，關(guān)節(jié)灌洗以及關(guān)節(jié)調(diào)壓治療。當(dāng)保守治療無效時(shí)，排除手術(shù)禁忌癥后可手術(shù)切除關(guān)節(jié)盤或行關(guān)節(jié)盤復(fù)位修補(bǔ)術(shù)[1-3]。但是手術(shù)治療與保守治療的長期觀察并未有明顯的差異，臨床會(huì)看到有些關(guān)節(jié)盤穿孔的患者通過保守治療幾年后復(fù)診，關(guān)節(jié)盤穿孔部位出現(xiàn)修復(fù)愈合。Koyama[4]等人首次在顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病患者的滑液中發(fā)現(xiàn)多潛能間充質(zhì)細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)研究表明，這類細(xì)胞可分化為軟骨、骨、脂肪、神經(jīng)組織。為了研究顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(synovial fluid-derived mesenchymal stem cells,SFMSCs)在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的作用，我們引入條件培養(yǎng)基來觀察人滑液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與大鼠關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞的相互作用，通過檢測(cè)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞生長、增殖以及特定的基因表達(dá)水平，初步探索這類細(xì)胞在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的作用。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 實(shí)驗(yàn)用SPF 級(jí)健康、雄性SD 大鼠，100g 左右,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(粵)2011-0029，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。低糖型DMEM、胎牛血清、PBS(Hyclone)，a-MEM、0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 購自Gibico 公司，Anti-Collagen Type I Rabbit pAb 購于Calbiochem R○公司，Triton X-100、Anti-Collagen II,N-Terminal antibody produced in rabbit 從SIGMA-ALDRICHTM 公司購買，DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit gG(H+L)(EARTHoX.LLC·San Francaco CA·USA)，小牛血清、DEPC 水(MP Biomedicals)，DAPI(Cell Signaling)，CCK 試劑盒(泛博生化)，細(xì)胞周期分析試劑盒(聯(lián)科生物Multisciences)，TRIzol R○Reagent(Ambion,Life Technologies)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)，LightCycler R○480 SYBR Green Master(Roche)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增

(1)人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞獲?。褐猩酱髮W(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院顳下頜關(guān)節(jié)病診治中心就診患者，實(shí)驗(yàn)前患者簽署知情同意書，該項(xiàng)目獲得中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。對(duì)需做造影檢查的顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病患者，8 號(hào)注射器關(guān)節(jié)上腔局部麻醉的同時(shí)注入1.5～2.0ml 利多卡因行關(guān)節(jié)上腔灌洗，收集注射器中的滑液[4]，300g/min 離心8min,加入含10%FBS 的alpha-MEM 轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中，48h 換液，利用干細(xì)胞的貼壁特性，分離提純。大約2 周后細(xì)胞長滿80%，1∶3 傳代，成脂、成骨、成軟骨確認(rèn)其多向分化能力。

(2)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞獲?。喝PF級(jí)SD 大鼠，無菌條件下依次解剖周圍皮膚、肌肉組織，血管鉗離斷分離下頜升支將髁突及其附著物取出，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)中。剝離周圍附著肌肉，分離去凈關(guān)節(jié)盤周邊附著的滑膜組織。用眼科剪將分離出的關(guān)節(jié)盤剪至1mm3大小，放入乘有質(zhì)量濃度為0.2%的I 型膠原酶的培養(yǎng)瓶中消化4h，離心棄上清液，PBS 沖洗再次離心棄上清液，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中使用含10%FBS 的低糖型-DMEM 培養(yǎng)(L-DMEM)，3～4 天換液，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80%后傳代[5]。

1.3 免疫熒光染色 取大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨P1 代細(xì)胞，按5×103/皿，接種至激光共聚焦皿中，培養(yǎng)24h 待細(xì)胞貼壁后，PBS 輕輕沖洗，4%多聚甲醛-20℃下固定30min，PBS 沖洗干凈加入0.3%Triton X-100 常溫下透膜15min,PBS 洗凈5%小牛血清(BSA)37℃封閉2h，I 型膠原抗體(1∶40)、II 型膠原抗體(1∶200)稀釋相應(yīng)倍數(shù)4℃過夜(＞16h)孵育一抗，37℃下孵育二抗1h，DAPI常溫染色5min，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及I 型膠原、II 型膠原熒光表達(dá)。

1.4 條件培養(yǎng)基制備 取P3 代SFMSCs 接種至75cm2培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞長至70%體積時(shí)換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 小時(shí)后，收集上清液，700g 離心8min 去除細(xì)胞碎片，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ〗鈨龅纳锨逡喊凑?∶2 體積比加入含10%FBS 新鮮的L-DMEM，制備條件培養(yǎng)基(SFMSC-CM)。

1.5 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞生長情況 取P1 代大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞，按照3×103/孔接種至96 孔板，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔平行對(duì)照。大約6h 后細(xì)胞貼壁，輕輕的吸掉原有的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組換用SFMSC-CM 每隔兩天換液，對(duì)照組使用含10%FBS 的L-DMEM 每隔三天換液。分別于0、1、2、3 天避光條件下加入CCK-8 試劑，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索條件，1h 后酶標(biāo)儀450nm 波長下檢測(cè)吸光度(OD)值。

1.6 RT-PCR 檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)情況 取P1代大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞，按照2×105密度接種至25cm2培養(yǎng)瓶中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔平行對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組加入SFMSC-CM 每隔2 天換液，對(duì)照組加入含10%FBS 的L-DMEM 每隔3 天換液。分別于7、14 天后收集樣本，使用TRIzol?提取RNA。提取的樣品測(cè)定濃度后，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系如下所示：取500ngRNA 樣品1ul Oligo(dT18)primer，加入DEPC 水至12ul，65℃孵育5min 冰上冷卻。依次加入4ul 5X Reaction Buffer、1ul RiboLock Rnase Inhibitor、2ul dNTP Mix、1ul RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase。42℃孵育60min，70℃孵育5min 終止反應(yīng)。使用SYBR?Green QPCR Master Mix 試劑，在LightCycler?480(Roche)進(jìn)行定量RT-PCR(qRT-PCR)。熒光定量PCR 反應(yīng)體系如下：2ul DNA 樣品加入正反向引物各1ul，DEPC 水6ul，SYBR 10ul。反應(yīng)過程如下:95℃5min 前期孵育，95℃10s、60℃20s、72℃30s 擴(kuò)增45 個(gè)循環(huán)，95℃5s、65℃1min、97℃持續(xù)，40℃30s 冷卻。按照K.J.Livak 等人[6]的方法計(jì)算與對(duì)照組相對(duì)CT 值(2-△△CT)作為基因水平表達(dá)的改變。采用GAPDH 作為管家基因，分析I 型膠原、II 型膠原、X 型膠原基因表達(dá)情況，上述基因引物合成如表1 所示，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

圖1 人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)觀察及多向分化

表1 RT-PCR引物合成序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有顯著性。

2.結(jié)果

2.1 人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和三向誘導(dǎo)分化 如圖1 所示：人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(SFMSCs)顯微鏡下呈現(xiàn)纖維樣形態(tài)(圖1A)；人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化，Von Kossa's 礦化結(jié)節(jié)染色(圖1B)；人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨誘導(dǎo)分化，軟骨塊切片II 型膠原染色(圖1C)；人顳下頜關(guān)節(jié)滑液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化，脂滴蘇丹黑染色(圖1D)。

2.2 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞I 型、II 型膠原激光共聚焦顯微鏡觀察 如圖2 所示，激光共聚焦顯微鏡下可看的細(xì)胞胞漿內(nèi)均有I 型、II 型膠原呈現(xiàn)綠色熒光表達(dá)，藍(lán)色熒光為DAPI 核染色。激光共聚焦顯微鏡下I 型膠原、II 型膠原均有表達(dá)，驗(yàn)證獲取的細(xì)胞為大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞。

圖2 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨I、II 型膠原免疫熒光染色

圖3 CCK-8 檢測(cè)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞0，24h，48h，72h 吸光度值

2.3 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 如圖3 所示，0，24h 時(shí)細(xì)胞吸光度值(OD 值)基本一致，表明細(xì)胞的增殖沒有出現(xiàn)明顯差異，48h，72h 實(shí)驗(yàn)組吸光度值明顯高于對(duì)照組，P＜0.001 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明條件培養(yǎng)基組細(xì)胞增殖速度明顯高于對(duì)照組。

2.4 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平的變化 如圖4 所示，第7 天，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組中Col I 型膠原mRNA 的含量表達(dá)明顯增加(圖4A)，Col X 型膠原mRNA 的含量表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)明顯降低(圖4C)；第14 天，與對(duì)照組相比Col I 型膠原mRNA 含量在實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)明顯降低(圖4A)，Col II 型膠原mRNA 含量在實(shí)驗(yàn)組中明顯增加(圖4B)，Col X 型膠原mRNA 的含量表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)明顯降低(圖4C)。

圖4 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平

3.討論

對(duì)于關(guān)節(jié)盤的病變，Lanze 在1909 年首次報(bào)道摘除關(guān)節(jié)盤治療TMD，但摘除關(guān)節(jié)盤后的髁突骨質(zhì)可發(fā)生退行性改變，例如：骨摩擦音、關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)吸收甚至出現(xiàn)纖維性關(guān)節(jié)強(qiáng)直。70 年代關(guān)節(jié)造影術(shù)的出現(xiàn)，明確證實(shí)了關(guān)節(jié)盤移位、穿孔的存在。隨后，McCarty 對(duì)327 例關(guān)節(jié)盤移位穿孔修復(fù)術(shù)2 年追蹤復(fù)查，成功率達(dá)到94%，開創(chuàng)了關(guān)節(jié)復(fù)位和修補(bǔ)術(shù)外科。但是關(guān)節(jié)盤穿孔手術(shù)治療與保守治療長期效果追蹤并沒有顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)[7]。

間充質(zhì)干細(xì)胞除了骨髓來源外，還存在于體內(nèi)多種組織中比如：牙髓、牙周膜、顳下頜關(guān)節(jié)滑液等。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察到這些細(xì)胞在損傷愈合中發(fā)揮重要的作用，它們不僅可以通過分化成不同的細(xì)胞調(diào)節(jié)修復(fù)進(jìn)程，也可以通過與多種組織和細(xì)胞(纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)相互作用提供組織組織再生和損傷修復(fù)的內(nèi)環(huán)境[8]。有研究表明關(guān)節(jié)內(nèi)出血、炎癥、韌帶斷裂、關(guān)節(jié)盤穿孔可能會(huì)增加滑液中的干細(xì)胞數(shù)量[4,9]，但是對(duì)這類細(xì)胞在關(guān)節(jié)內(nèi)的具體作用還不清楚。我們使用顳下頜關(guān)節(jié)滑液間充質(zhì)干細(xì)胞制作條件培養(yǎng)基，CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明SFMSC-CM 促進(jìn)關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞的增殖，該結(jié)果與之前在機(jī)體的其他器官例(腦、心臟、腎臟)[10]一致。

I 型膠原和II 型膠原是關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞中常見的兩種膠原，對(duì)于它們之間的含量變化，目前還沒有得出明確的結(jié)論，一般認(rèn)為I 型膠原的增加可能與軟骨去分化有關(guān)[11]。通過RT-PCR 檢測(cè)軟骨相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，I 型膠原在第7 天時(shí)實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量比對(duì)照組增加，然而14 天后對(duì)照組的表達(dá)量高于實(shí)驗(yàn)組。II 型膠原在第7 天時(shí)兩組沒有明顯差異，第14 天后實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量高于對(duì)照組。我們認(rèn)為第7 天I 型膠原實(shí)驗(yàn)組含量的增加其原因可能是可能是細(xì)胞的增殖速度增加，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)去分化現(xiàn)象。第14 天時(shí)由于培養(yǎng)瓶的體積有限，細(xì)胞生長受到限制，細(xì)胞不再增殖，然而SFMSCCM 可能抑制軟骨細(xì)胞去分化，因而出現(xiàn)I 型膠原表達(dá)量下降的現(xiàn)象，II 型膠原實(shí)驗(yàn)組的含量高于對(duì)照組。X 型膠原一般認(rèn)為是細(xì)胞肥大的標(biāo)識(shí)[11]，我們的實(shí)驗(yàn)觀察第7 天、14 天時(shí)實(shí)驗(yàn)組含量均明顯低于對(duì)照組，表明SFMSC-CM 通過抑制軟骨細(xì)胞的X 型膠原表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞肥大作用。

我們的實(shí)驗(yàn)通過體外條件培養(yǎng)基模擬顳下頜關(guān)節(jié)滑液中的干細(xì)胞分泌物，發(fā)現(xiàn)這些分泌物對(duì)關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖，RT-PCR 檢測(cè)相關(guān)基因顯示可以維持軟骨細(xì)胞表型，抑制肥大。今后我們將進(jìn)一步明確分泌物的作用通路及干細(xì)胞的遷移機(jī)制促使更多的干細(xì)胞參與關(guān)節(jié)盤穿孔的修復(fù)，為關(guān)節(jié)盤穿孔提供新的治療方法。