謝明冬，張弛★，余涵，于鵬坤，吳佳航，董思佳，許歡，周天，梁舒敏

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都；2.四川省第二中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都）

0 引言

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis, KOA)主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨破壞、關(guān)節(jié)軟骨下骨板病變?yōu)樘卣鞯穆?、進(jìn)行性加重的疾病。其發(fā)病與年齡成正相關(guān)，據(jù)統(tǒng)計，65歲以上的老年人發(fā)病率為75%[1]。該疾病已經(jīng)嚴(yán)重影響到中老年人的生活，但本病的發(fā)病機制尚不完全清楚，可能與軟骨細(xì)胞的基質(zhì)合成代謝失衡、免疫反應(yīng)、關(guān)節(jié)力學(xué)的改變等有關(guān)[2]，如何治療膝骨關(guān)節(jié)炎始終是臨床熱點話題。祖國醫(yī)學(xué)對于該類勞損性疾病有著深刻的見解，本研究基于“筋為骨用”理論，以KOA家兔模型為對象，觀察“舒筋”手法對KOA軟骨組織修復(fù)效果，為手法治療KOA提供實驗數(shù)據(jù)支持。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

選50只雌雄各半體重約2.0～2.5kg的健康成年家兔。（由四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供，在成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心集中飼養(yǎng)，本實驗通過醫(yī)學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。）

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

木瓜蛋白酶（Sigma公司），玻璃酸鈉注射液（山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司），蘇木素-伊紅染液、番紅固綠染色試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司）、病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）、高速冷凍離心機（賽默飛公司）等。

1.3 造模與分組干預(yù)

50只成年家兔隨機分為空白組（12只）和干預(yù)組（38只），采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射方法制備家兔KOA 模型[3]，方法如下：家兔仰臥位固定，取右后膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)為穿刺區(qū)，局部備皮，常規(guī)消毒后用1mL注射器行右膝關(guān)節(jié)穿刺，注射4%濃度木瓜蛋白酶溶液0.3mL，造模開始的第1、4、7 天注射，共3次?？瞻捉M不做任何處理。造模結(jié)束一周后，隨機抽取2只干預(yù)組家兔檢驗造模是否成功[3]。確認(rèn)成功造模后，將36只家兔平均隨機分為模型組、玻璃酸鈉組、手法組，具體分組如下：

①空白組：常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)。

②模型組：常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)。

③玻璃酸鈉組：右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉注射液0.2mL，1周1次，連續(xù)注射5周。

④手法組：于右膝關(guān)節(jié)行“舒筋”推拿手法治療，1次12時長分鐘，隔日一次（按1992年中國針灸學(xué)會實驗針灸研究會學(xué)術(shù)會議制定的實驗動物針灸穴位定位標(biāo)準(zhǔn)取穴和操作，部分未包括的則按人體對應(yīng)取穴和操作）。

1.4 舒筋手法操作及要點

1.4.1 揉法

操作時助手將家兔耳朵以及雙前肢固定，術(shù)者一只手握住家兔雙后肢，另一手取拇指和食指揉捏右側(cè)膝關(guān)節(jié)梁丘+委中、足三里+中都、陰陵泉+陽陵泉、血海+犢鼻、伏兔（股直肌隆起處）+殷門（大腿后側(cè)中點）。根據(jù)穴位的位置，兼顧操作的便利性，故一次選兩個穴位。

1.4.2 拿法

家兔取側(cè)臥位固定后，拇指和其余四指對向用力拿股四頭肌至髕韌帶。

1.4.3 分筋

家兔取側(cè)臥位固定，以拇指和中指在內(nèi)、外膝眼，內(nèi)、外側(cè)副韌帶，腓腸肌內(nèi)外側(cè)頭由輕至重進(jìn)行操作，。

1.4.4 搓膝

家兔取側(cè)臥位固定，用拇指和食指在右膝髕底、髕尖、髕骨兩側(cè)關(guān)節(jié)周圍進(jìn)行操作。

1.4.5 操作要點

選穴多以膝關(guān)節(jié)周圍穴位為主，要求力度柔和，頻率適中。搓膝手法中強調(diào)出現(xiàn)熱感；

1.5 標(biāo)本采集與預(yù)處理

軟骨采集：分別于干預(yù)后的第8周和第12周末，各組均處死6只家兔，打開膝關(guān)節(jié)觀察并拍照記錄關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)，用手術(shù)刀取大小約為0.5cm3的軟骨塊，取后即刻放置于-80℃冰凍保存待測。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 動物一般狀態(tài)觀察

觀察干預(yù)第8周和第12周后各組動物的精神狀態(tài)，毛發(fā)色澤以及飲食情況等，同時用改良的LequesneMG膝關(guān)節(jié)級別評估方法[5]對家兔右膝關(guān)節(jié)局部反應(yīng)、活動范圍、腫脹情況及步態(tài)等進(jìn)行綜合評估。

1.6.2 關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)觀察

各組分別于干預(yù)后的第8周和12周末處死6只家兔，打開右膝關(guān)節(jié)腔，充分顯露股骨遠(yuǎn)端及脛骨平臺，觀察關(guān)節(jié)軟骨的光滑度及色澤、觀察軟骨面是否有糜爛及潰瘍、局部是否有增生及骨贅形成等，同時根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)學(xué)評分原則進(jìn)行評分[6]。

1.6.3 關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)觀察

將不同時間點采集的關(guān)節(jié)軟骨以4%多聚甲醛固定、梯度酒精脫水、包埋、冷卻后切片，后用HE及番紅固綠染色。在光鏡下觀測已切片、染色的關(guān)節(jié)軟骨，并按Mankin’s評分標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行評分，并拍攝照片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般狀態(tài)觀察

在整個實驗過程中，所有家兔均存活，一般狀態(tài)良好。第8周時，空白組、玻璃酸鈉組、手法組動物的精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，飲食正常；模型組動物精神稍差，毛發(fā)光澤稍減低，飲食減少。第12周末觀察空白組、玻璃酸鈉組、手法組家兔精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，飲正常，模型組家兔精神較前好轉(zhuǎn)，毛發(fā)光澤較前有所改善，飲食量增加。

表1 改良LequesneMG評分比較（±s）

表1 改良LequesneMG評分比較（±s）

組別 例數(shù)（n） 第8周末評分 第12周末評分空白組 6 0.33±0.52 0.50±0.55模型組 6 6.00±1.41 4.67±1.03玻璃酸鈉組 6 2.67±0.82 1.50±0.55手法組 6 2.83±0.75 1.67±0.82

從表1得知，經(jīng)玻璃酸鈉注射、“舒筋”手法治療后，改良LequesneMG評分均有所下降（P＜0.05），并且評分相近（P＞0.05），第12周末的評分較第8周末有所減少（P＜0.05）。表明玻璃酸鈉注射治療、“舒筋”手法治療均可降低評分，并且12周的療效優(yōu)于8周。

2.2 關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)及組織學(xué)觀察

2.2.1 肉眼大體形態(tài)觀察

第8周時見空白組家兔關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，無明顯骨贅，軟骨完整，色澤正常；模型組家兔關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，可見部分骨贅，軟骨色澤灰暗，部分剝脫伴軟骨下骨顯露；玻璃酸鈉組家兔關(guān)節(jié)軟骨表面稍粗糙，無明顯骨贅，軟骨面色澤稍灰暗；手法組關(guān)節(jié)軟骨表面欠光滑，部分可見極少量骨贅形成，軟骨面色澤稍暗。

第12周末空白組、模型組家兔大體形態(tài)情況較前無明顯變化，干預(yù)組家兔關(guān)節(jié)軟骨表面較前稍顯光滑，光澤度較前有所好轉(zhuǎn)。

第8周末光鏡下觀察(×200)

表2 關(guān)節(jié)軟骨大體評分比較（±s）

表2 關(guān)節(jié)軟骨大體評分比較（±s）

組別 例數(shù)（n） 第8周末評分 第12周末評分空白組 6 0.17±0.41 0.00±0.00模型組 6 3.17±0.75 3.00±0.89玻璃酸鈉組 6 2.00±0.63 1.67±0.75手法組 6 2.17±0.75 1.00±0.63

從表3得知，經(jīng)玻璃酸鈉注射、“舒筋”手法治療后，關(guān)節(jié)軟骨大體評分均有所下降（P＜0.05），并且評分相近（P＞0.05），第 12周末的評分較第8周末有所減少（P＜0.05）。表明玻璃酸鈉注射治療、“舒筋”手法治療均可降低關(guān)節(jié)軟骨大體評分，且第12周的療效優(yōu)于第8周。

2.2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

見圖1。

第12周末光鏡下觀察(×200)

表3 Mankin’s評分比較（±s）

表3 Mankin’s評分比較（±s）

從表4得知，經(jīng)玻璃酸鈉注射、“舒筋”手法治療后，Mankin’s評分均有所下降（P＜0.05），并且評分相近（P＞0.05），第12周末的評分較第8周末有所減少（P＜0.05）。表明玻璃酸鈉注射治療、“舒筋”手法治療均可降低Mankin’s評分，并且第12周的療效優(yōu)于第8周。

組別 例數(shù)（n） 第8周末Mankin’s評分 第12周末Mankin’s評分空白組 6 0.17±0.41 0.17±0.41模型組 6 8.67±1.21 7.83±0.98玻璃酸鈉組 6 4.83±0.98 2.33±1.03手法組 6 4.17±1.17 2.33±1.03

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee osteoarthritis ，KOA）是以疼痛、畸形、功能障礙為主要特點的臨床常見多發(fā)病，已嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量。研究表明，正常關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，軟骨細(xì)胞占整個軟骨體積的2%以下[8]。膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展以軟骨細(xì)胞的凋亡、軟骨的破壞為結(jié)果，所以針對關(guān)節(jié)軟骨的破壞做針對性的處理就能減緩甚至最終達(dá)到治愈膝骨關(guān)節(jié)炎的目的。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對于KOA有較早的認(rèn)識，認(rèn)為“筋”與“骨”密不可分，急性損傷或慢性勞損造成膝關(guān)節(jié)周圍軟組織損傷，進(jìn)而引起損傷軟組織的攣縮與粘連，繼而引發(fā)軟骨退變、骨質(zhì)增生等病變，即傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中所說的“筋病”引起“骨病”，由此可見“筋”在KOA發(fā)病中具有重要作用，也表明“筋病”是KOA發(fā)生發(fā)展的重要病變基礎(chǔ)。而以“筋骨并重”理論為指導(dǎo)治療KOA已被無數(shù)臨床實踐所證實?！笆娼睢笔址ㄍㄟ^揉法、拿法、分筋、搓膝等方法對膝關(guān)節(jié)周圍軟組織進(jìn)行松解，促進(jìn)局部攣縮軟組織的放松，從而達(dá)到放松局部肌肉，減輕疼痛。同時通過手法產(chǎn)生的溫?zé)嵝?yīng)以改善膝關(guān)節(jié)周圍的血液循環(huán)，加快軟組織的修復(fù)，恢復(fù)下肢關(guān)節(jié)的力線，達(dá)到治療目的。

課題組在組織病理學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)：第8周末和第12周末，玻璃酸鈉組和手法組的軟骨破壞程度均低于模型組，表明兩種干預(yù)方式對促進(jìn)KOA的軟骨修復(fù)均有一定的作用；與第8周末情況相比，第12周末對照組和手法組軟骨情況都有一定程度的好轉(zhuǎn)，并且軟骨細(xì)胞排列較整齊，接近空白組，說明干預(yù)12周的療效優(yōu)于8周；第8周末和第12周末的組間比較發(fā)現(xiàn)玻璃酸鈉和手法組無明顯差異，表明兩者療效近似，但相對于玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，傳統(tǒng)舒筋手法具有無創(chuàng)的優(yōu)勢，故更容易被患者接受。