田 霄 汪 威田云霞 童江云

（昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南昆明650000）

金耳（Tremella aurantialba），也稱腦型銀耳、金銀耳，隸屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）銀耳科（Tremella）銀耳屬（Tremella），是一種珍貴的食藥同源真菌。金耳子實(shí)體外觀呈腦狀，色澤金黃，富含膠質(zhì)，食用口感爽滑；臨床研究發(fā)現(xiàn)金耳多糖具有降低血糖、血脂，增強(qiáng)免疫力[1]，抗凝血[2]和抗腫瘤[3]等效果。金耳是食用菌中珍品，也是保健美容佳品，有著廣闊的發(fā)展前景。

早在1982―1996年，劉正南等[4]成功引種馴化了野生金耳，并進(jìn)行大面積推廣，取得了良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。由于金耳自身特殊的生理特性和制種特性，金耳菌種尚不穩(wěn)定。代料栽培金耳在原基形成初期容易遭到雜菌感染，導(dǎo)致爛耳和出耳不整齊，嚴(yán)重影響金耳產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率[5]，阻礙了代料栽培金耳的大規(guī)模推廣。研究金耳出耳期的病害發(fā)生原因，是降低金耳污染率，提高金耳產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益的重要環(huán)節(jié)。

真菌的ITS基因相比18SrRNA基因（其進(jìn)化速率為18SrDNA的10倍）或28SrRNA基因而言整體的變異性更強(qiáng)，因而物種間的序列差異會(huì)更大，分類信息會(huì)更加詳盡，具有高通量、高精度、極佳重現(xiàn)性和測序成本低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究[6]。ITS包含ITS1和ITS2兩個(gè)區(qū)域。ITS1位于真核生物18S和5.8S基因之間，ITS2位于真核生物5.8S和28S基因之間，其序列更長且包含信息更多。筆者選取代料栽培金耳出耳期受感染部位，進(jìn)行ITS2高通量測序和菌種分離，分析其主要的真菌群落，為代料栽培金耳出耳期雜菌防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）供試菌種：從云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院引進(jìn)金耳與毛韌革菌混合菌種。將混合菌種擴(kuò)繁，待出耳且耳塊長至5 cm左右后置于-4℃冰箱保存。（2）供試配方：栽培料配方為粗木屑79%，麩皮15%，硫酸鈣1%，碳酸鈣1%。（3）主要試劑和儀器。PCR采用KOD-401B：TOYOBO KOD-Plus-Neo DNA Polymerase；PCR 儀 ：Applied Biosystems?Gene Amp?PCR System 9700。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 代料培養(yǎng)

按配方制備栽培袋（121℃高壓滅菌3 h）。將保藏的菌種從冰箱取出置于室溫下，在無菌條件下，在栽培袋側(cè)面部位打孔（直徑約2 cm，深度約2 cm），挑取子實(shí)體1～2 cm和子實(shí)體下方少許混合菌絲接入栽培袋孔內(nèi)，用透氣密封條密封口，放置溫度20～23℃，黑暗環(huán)境中培養(yǎng)30 d左右，至袋內(nèi)長滿白色粗壯的菌絲。此后10 d左右，接種塊附近出現(xiàn)黃色分泌物，逐漸形成腦狀原基。

1.2.2 取材

在原基形成后10 d內(nèi)，選取受到雜菌感染的菌包，分別挑取三個(gè)樣本：被感染的接種部位的培養(yǎng)料、菌包中間和底部的培養(yǎng)料，編號為TA-ZJ、TA1和TA2（圖1）。每個(gè)樣本5重復(fù)。

圖1 金耳正常出耳、污染狀態(tài)及采樣處

1.2.3 樣本DNA的提取與純化

利用DNA提取試劑盒（Zymo Research BIOMICS DNA Microprep Kit D4301）對3個(gè)樣本進(jìn)行基因組DNA抽提。0.8%瓊脂糖凝膠電泳對所提DNA進(jìn)行檢測。

1.2.4 ITS片段高通量測序鑒定

1.2.4.1 PCR擴(kuò)增

利 用 特 異 引 物（ITS3_KYO2：5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’和 ITS4：5’-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3’）對樣本DNA的ITS2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增[7]：每個(gè)樣本進(jìn)行3次PCR重復(fù)。

1.2.4.2 PCR產(chǎn)物檢測、純化和定量

利用2%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。切膠回收（QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN）。

1.2.4.3 文庫構(gòu)建

文庫構(gòu)建用Illumina公司TruSeq DNA PCRFree Sample Prep Kit（FC-121-3001/3003）。

1.2.4.4 測序和生物信息分析及統(tǒng)計(jì)

用FLASH拼接雙端序列?；贐arcode從reads中拆分出各樣本序列。截去Barcode序列得到原始數(shù)據(jù)，然后用Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)控。得到有效數(shù)據(jù)Clean Reads。

使用UCLUST分類法與UNITE數(shù)據(jù)庫（https：//unite.ut.ee/）進(jìn)行注釋分析。用MAFFT version 7的FFT-NS-2算法將代表性序列進(jìn)行多重比對。對各樣本做均一化處理，以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重抽樣。

采用R語言進(jìn)行各種數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，ggplot2構(gòu)建熱圖。

1.2.5 真菌形態(tài)學(xué)鑒定

1.2.5.1 感染真菌的分離與純化

采集的3個(gè)樣本無菌條件下放置在PDF平板上，25℃培養(yǎng)至菌落形成。挑取平板上不同菌落的邊緣部位進(jìn)行多次純化分離。

1.2.5.2 真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將純化的菌株接種到PDA平板上，采用插片培養(yǎng)法，在接種平板邊緣以45°斜插入3片蓋玻片，25℃培養(yǎng)至菌絲長滿平板。取出蓋玻片制作成臨時(shí)片，在電子顯微鏡下做鏡檢并拍照。參照文獻(xiàn)將各真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[8-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌群落組成分析

根據(jù)測序結(jié)果分析，3個(gè)樣本相對豐度水平最高的菌群均為子囊菌門（Ascomycota）木霉屬（Trichoderma）；同時(shí)在3個(gè)樣本中相對豐度水平較高的菌群有擔(dān)子菌門（Basidiomycota）考克娃酵母屬（Kockovaella）、子囊菌門（Ascomycota）鐮刀霉屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、擬青霉 屬（Simplicillium）和 頭 束 霉 屬（Cephalotrichum）（圖2）。

3個(gè)樣本中，在TA1和TA2中發(fā)現(xiàn)的被孢霉門（Mortierellomycota）被孢霉屬（Mortierella）群落相對豐度水平比樣本TA-ZJ高，而擔(dān)子菌門（Basidiomycota）柄環(huán)菌屬（Podoscypha）、壺菌門（Chytridiomycota）小壺菌屬（Spizellomyces）在TA-ZJ樣本中未能鑒定到。

木霉屬在整個(gè)序列相對豐度水平中，樣本TA1達(dá)35%，TA2達(dá)19%，TA-ZJ高達(dá)63%。毛韌革菌所在的韌革菌屬（Stereum）占據(jù)了較高的比例，相對豐度值分別為29%、38%和10%。金耳所在的銀耳屬（Tremella）占比較低，3個(gè)樣本平均不到5%。

圖2 各樣本的感染真菌群落（屬）

圖3 感染真菌純化菌株及其顯微結(jié)構(gòu)

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)多次分離純化后總共獲得了100個(gè)菌株，形態(tài)學(xué)分析主要屬于木霉屬（分離菌株數(shù)75個(gè)）、鐮刀霉屬（分離菌株數(shù)7個(gè)）和青霉屬（分離菌株數(shù)8個(gè)）其他菌株10個(gè)（圖3A、B、C），經(jīng)顯微結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)一步證明其確實(shí)屬于木霉屬（圖3A）、鐮刀霉屬（圖3E）和青霉屬（圖3F）真菌。

3 小結(jié)與討論

食用菌病害根據(jù)病害發(fā)生的原因分為三種類型：侵染性病害、競爭性病害和生理性病害。侵染性病害主要是病原菌侵染食用菌本身，導(dǎo)致菌絲死亡或者子實(shí)體出現(xiàn)斑點(diǎn)、畸形甚至腐爛；競爭性病害則是病原菌侵染栽培基質(zhì)，與菌絲體爭奪養(yǎng)分和生存空間導(dǎo)致食用菌凋亡[11]。金耳子實(shí)體是由金耳和毛韌革菌組成的異質(zhì)復(fù)合體[12]，兩者的關(guān)系目前還不夠清晰[13]，關(guān)于金耳的主要病害研究目前鮮有報(bào)道。金耳出耳期發(fā)生病害的原因：接種栽培場地和栽培料因素，環(huán)境因素、水源因素，料袋滅菌因素，袋的質(zhì)量因素，出耳期的濕度和通風(fēng)管理因素等。金耳生長前期以毛韌革菌菌絲生長為主，到一定程度后金耳菌絲才開始生長[14]，兩者比例失調(diào)會(huì)導(dǎo)致出耳率下降[15]，金耳幼耳本身抗病性差，且對不良環(huán)境敏感[1]，在開袋后容易受到來自外界空氣和水中廣泛存在的木霉、青霉等真菌病原菌的侵染而發(fā)生病害。

ITS2高通量測序結(jié)果表明，取樣點(diǎn)主要感染菌群落屬于子囊菌門木霉屬，按豐度水平依次為孢霉屬、鐮刀霉屬、考克娃酵母屬、曲霉屬、青霉屬、擬青霉屬和頭束霉屬。金耳出耳初期容易分泌黃水[5]，開袋后與外界空氣接觸，容易受到雜菌侵染。試驗(yàn)出菇房曾多年栽培香菇和平菇等菇類，雜菌孢子基數(shù)高，而金耳出耳期需要較高的空氣相對濕度，若通風(fēng)控制不當(dāng)，易造成木霉感染。試驗(yàn)取樣的菌袋前期菌絲生長正常，開袋出耳后出現(xiàn)感染，因此病原菌來自袋外可能性較高。形態(tài)學(xué)分析僅鑒定到三種真菌：木霉屬、鐮刀霉屬和青霉屬，其中分離木霉屬菌株數(shù)最高，這一結(jié)果與高通量測序結(jié)果一致。另外從高通量測序結(jié)果可以看出，除了木霉屬，其余雜菌屬相對豐度水平都很低。肉眼觀測取樣的菌袋大部分為綠色木霉污染（圖1），因受試驗(yàn)方法限制，僅能分離和提純得到少量的屬種。

自然界中各種微生物的種類和數(shù)量非常多，而木霉是感染食用菌培養(yǎng)料和子實(shí)體最嚴(yán)重的一種雜菌，筆者試驗(yàn)得出同樣結(jié)果。為此，筆者對金耳出耳期的管理提出幾點(diǎn)建議：首先，控制病原菌。木霉孢子及菌絲體廣泛分布在自然界中，木霉等多數(shù)雜菌生長適溫為22～28℃，與金耳菌絲生長適溫相近，木霉菌絲很容易在金耳菌絲生長期大量繁殖，出耳期爆發(fā)。預(yù)防原則：一是源頭把控，降低環(huán)境中雜菌基數(shù)、用水潔凈，培養(yǎng)料滅菌徹底；其次，優(yōu)化管理。木霉、青霉等雜菌喜歡高濕環(huán)境，其菌絲較耐二氧化碳，而金耳子實(shí)體的展開和轉(zhuǎn)色也需要一定的氧氣量，因此要協(xié)調(diào)好金耳出耳期的濕度與通氣，保持空氣相對濕度在85%～95%，隨時(shí)監(jiān)測出菇房內(nèi)二氧化碳濃度，做到每天定時(shí)通風(fēng)換氣；第三，選擇優(yōu)良的金耳菌種及適宜代料配方，培養(yǎng)出高質(zhì)量金耳出菇菌袋[11，16]。