亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        代料栽培金耳出耳期易感染真菌病害多樣性初探

        2020-03-30 14:26:02威田云霞童江云
        食用菌 2020年2期

        田 霄 汪 威田云霞 童江云

        (昆明市農(nóng)業(yè)科學研究院,云南昆明650000)

        金耳(Tremella aurantialba),也稱腦型銀耳、金銀耳,隸屬擔子菌門(Basidiomycota)銀耳科(Tremella)銀耳屬(Tremella),是一種珍貴的食藥同源真菌。金耳子實體外觀呈腦狀,色澤金黃,富含膠質(zhì),食用口感爽滑;臨床研究發(fā)現(xiàn)金耳多糖具有降低血糖、血脂,增強免疫力[1],抗凝血[2]和抗腫瘤[3]等效果。金耳是食用菌中珍品,也是保健美容佳品,有著廣闊的發(fā)展前景。

        早在1982―1996年,劉正南等[4]成功引種馴化了野生金耳,并進行大面積推廣,取得了良好的經(jīng)濟和社會效益。由于金耳自身特殊的生理特性和制種特性,金耳菌種尚不穩(wěn)定。代料栽培金耳在原基形成初期容易遭到雜菌感染,導致爛耳和出耳不整齊,嚴重影響金耳產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率[5],阻礙了代料栽培金耳的大規(guī)模推廣。研究金耳出耳期的病害發(fā)生原因,是降低金耳污染率,提高金耳產(chǎn)量和經(jīng)濟效益的重要環(huán)節(jié)。

        真菌的ITS基因相比18SrRNA基因(其進化速率為18SrDNA的10倍)或28SrRNA基因而言整體的變異性更強,因而物種間的序列差異會更大,分類信息會更加詳盡,具有高通量、高精度、極佳重現(xiàn)性和測序成本低等特點,被廣泛應用于微生物生態(tài)學研究[6]。ITS包含ITS1和ITS2兩個區(qū)域。ITS1位于真核生物18S和5.8S基因之間,ITS2位于真核生物5.8S和28S基因之間,其序列更長且包含信息更多。筆者選取代料栽培金耳出耳期受感染部位,進行ITS2高通量測序和菌種分離,分析其主要的真菌群落,為代料栽培金耳出耳期雜菌防控提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 供試材料

        (1)供試菌種:從云南省農(nóng)業(yè)科學研究院引進金耳與毛韌革菌混合菌種。將混合菌種擴繁,待出耳且耳塊長至5 cm左右后置于-4℃冰箱保存。(2)供試配方:栽培料配方為粗木屑79%,麩皮15%,硫酸鈣1%,碳酸鈣1%。(3)主要試劑和儀器。PCR采用KOD-401B:TOYOBO KOD-Plus-Neo DNA Polymerase;PCR 儀 :Applied Biosystems?Gene Amp?PCR System 9700。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 代料培養(yǎng)

        按配方制備栽培袋(121℃高壓滅菌3 h)。將保藏的菌種從冰箱取出置于室溫下,在無菌條件下,在栽培袋側(cè)面部位打孔(直徑約2 cm,深度約2 cm),挑取子實體1~2 cm和子實體下方少許混合菌絲接入栽培袋孔內(nèi),用透氣密封條密封口,放置溫度20~23℃,黑暗環(huán)境中培養(yǎng)30 d左右,至袋內(nèi)長滿白色粗壯的菌絲。此后10 d左右,接種塊附近出現(xiàn)黃色分泌物,逐漸形成腦狀原基。

        1.2.2 取材

        在原基形成后10 d內(nèi),選取受到雜菌感染的菌包,分別挑取三個樣本:被感染的接種部位的培養(yǎng)料、菌包中間和底部的培養(yǎng)料,編號為TA-ZJ、TA1和TA2(圖1)。每個樣本5重復。

        圖1 金耳正常出耳、污染狀態(tài)及采樣處

        1.2.3 樣本DNA的提取與純化

        利用DNA提取試劑盒(Zymo Research BIOMICS DNA Microprep Kit D4301)對3個樣本進行基因組DNA抽提。0.8%瓊脂糖凝膠電泳對所提DNA進行檢測。

        1.2.4 ITS片段高通量測序鑒定

        1.2.4.1 PCR擴增

        利 用 特 異 引 物(ITS3_KYO2:5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’和 ITS4:5’-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3’)對樣本DNA的ITS2區(qū)域進行擴增[7]:每個樣本進行3次PCR重復。

        1.2.4.2 PCR產(chǎn)物檢測、純化和定量

        利用2%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。切膠回收(QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN)。

        1.2.4.3 文庫構(gòu)建

        文庫構(gòu)建用Illumina公司TruSeq DNA PCRFree Sample Prep Kit(FC-121-3001/3003)。

        1.2.4.4 測序和生物信息分析及統(tǒng)計

        用FLASH拼接雙端序列?;贐arcode從reads中拆分出各樣本序列。截去Barcode序列得到原始數(shù)據(jù),然后用Trimmomatic進行質(zhì)控。得到有效數(shù)據(jù)Clean Reads。

        使用UCLUST分類法與UNITE數(shù)據(jù)庫(https://unite.ut.ee/)進行注釋分析。用MAFFT version 7的FFT-NS-2算法將代表性序列進行多重比對。對各樣本做均一化處理,以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標準進行重抽樣。

        采用R語言進行各種數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,ggplot2構(gòu)建熱圖。

        1.2.5 真菌形態(tài)學鑒定

        1.2.5.1 感染真菌的分離與純化

        采集的3個樣本無菌條件下放置在PDF平板上,25℃培養(yǎng)至菌落形成。挑取平板上不同菌落的邊緣部位進行多次純化分離。

        1.2.5.2 真菌的形態(tài)學鑒定

        將純化的菌株接種到PDA平板上,采用插片培養(yǎng)法,在接種平板邊緣以45°斜插入3片蓋玻片,25℃培養(yǎng)至菌絲長滿平板。取出蓋玻片制作成臨時片,在電子顯微鏡下做鏡檢并拍照。參照文獻將各真菌進行形態(tài)學鑒定[8-10]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 真菌群落組成分析

        根據(jù)測序結(jié)果分析,3個樣本相對豐度水平最高的菌群均為子囊菌門(Ascomycota)木霉屬(Trichoderma);同時在3個樣本中相對豐度水平較高的菌群有擔子菌門(Basidiomycota)考克娃酵母屬(Kockovaella)、子囊菌門(Ascomycota)鐮刀霉屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、擬青霉 屬(Simplicillium)和 頭 束 霉 屬(Cephalotrichum)(圖2)。

        3個樣本中,在TA1和TA2中發(fā)現(xiàn)的被孢霉門(Mortierellomycota)被孢霉屬(Mortierella)群落相對豐度水平比樣本TA-ZJ高,而擔子菌門(Basidiomycota)柄環(huán)菌屬(Podoscypha)、壺菌門(Chytridiomycota)小壺菌屬(Spizellomyces)在TA-ZJ樣本中未能鑒定到。

        木霉屬在整個序列相對豐度水平中,樣本TA1達35%,TA2達19%,TA-ZJ高達63%。毛韌革菌所在的韌革菌屬(Stereum)占據(jù)了較高的比例,相對豐度值分別為29%、38%和10%。金耳所在的銀耳屬(Tremella)占比較低,3個樣本平均不到5%。

        圖2 各樣本的感染真菌群落(屬)

        圖3 感染真菌純化菌株及其顯微結(jié)構(gòu)

        2.2 形態(tài)學鑒定

        經(jīng)多次分離純化后總共獲得了100個菌株,形態(tài)學分析主要屬于木霉屬(分離菌株數(shù)75個)、鐮刀霉屬(分離菌株數(shù)7個)和青霉屬(分離菌株數(shù)8個)其他菌株10個(圖3A、B、C),經(jīng)顯微結(jié)構(gòu)鑒定進一步證明其確實屬于木霉屬(圖3A)、鐮刀霉屬(圖3E)和青霉屬(圖3F)真菌。

        3 小結(jié)與討論

        食用菌病害根據(jù)病害發(fā)生的原因分為三種類型:侵染性病害、競爭性病害和生理性病害。侵染性病害主要是病原菌侵染食用菌本身,導致菌絲死亡或者子實體出現(xiàn)斑點、畸形甚至腐爛;競爭性病害則是病原菌侵染栽培基質(zhì),與菌絲體爭奪養(yǎng)分和生存空間導致食用菌凋亡[11]。金耳子實體是由金耳和毛韌革菌組成的異質(zhì)復合體[12],兩者的關系目前還不夠清晰[13],關于金耳的主要病害研究目前鮮有報道。金耳出耳期發(fā)生病害的原因:接種栽培場地和栽培料因素,環(huán)境因素、水源因素,料袋滅菌因素,袋的質(zhì)量因素,出耳期的濕度和通風管理因素等。金耳生長前期以毛韌革菌菌絲生長為主,到一定程度后金耳菌絲才開始生長[14],兩者比例失調(diào)會導致出耳率下降[15],金耳幼耳本身抗病性差,且對不良環(huán)境敏感[1],在開袋后容易受到來自外界空氣和水中廣泛存在的木霉、青霉等真菌病原菌的侵染而發(fā)生病害。

        ITS2高通量測序結(jié)果表明,取樣點主要感染菌群落屬于子囊菌門木霉屬,按豐度水平依次為孢霉屬、鐮刀霉屬、考克娃酵母屬、曲霉屬、青霉屬、擬青霉屬和頭束霉屬。金耳出耳初期容易分泌黃水[5],開袋后與外界空氣接觸,容易受到雜菌侵染。試驗出菇房曾多年栽培香菇和平菇等菇類,雜菌孢子基數(shù)高,而金耳出耳期需要較高的空氣相對濕度,若通風控制不當,易造成木霉感染。試驗取樣的菌袋前期菌絲生長正常,開袋出耳后出現(xiàn)感染,因此病原菌來自袋外可能性較高。形態(tài)學分析僅鑒定到三種真菌:木霉屬、鐮刀霉屬和青霉屬,其中分離木霉屬菌株數(shù)最高,這一結(jié)果與高通量測序結(jié)果一致。另外從高通量測序結(jié)果可以看出,除了木霉屬,其余雜菌屬相對豐度水平都很低。肉眼觀測取樣的菌袋大部分為綠色木霉污染(圖1),因受試驗方法限制,僅能分離和提純得到少量的屬種。

        自然界中各種微生物的種類和數(shù)量非常多,而木霉是感染食用菌培養(yǎng)料和子實體最嚴重的一種雜菌,筆者試驗得出同樣結(jié)果。為此,筆者對金耳出耳期的管理提出幾點建議:首先,控制病原菌。木霉孢子及菌絲體廣泛分布在自然界中,木霉等多數(shù)雜菌生長適溫為22~28℃,與金耳菌絲生長適溫相近,木霉菌絲很容易在金耳菌絲生長期大量繁殖,出耳期爆發(fā)。預防原則:一是源頭把控,降低環(huán)境中雜菌基數(shù)、用水潔凈,培養(yǎng)料滅菌徹底;其次,優(yōu)化管理。木霉、青霉等雜菌喜歡高濕環(huán)境,其菌絲較耐二氧化碳,而金耳子實體的展開和轉(zhuǎn)色也需要一定的氧氣量,因此要協(xié)調(diào)好金耳出耳期的濕度與通氣,保持空氣相對濕度在85%~95%,隨時監(jiān)測出菇房內(nèi)二氧化碳濃度,做到每天定時通風換氣;第三,選擇優(yōu)良的金耳菌種及適宜代料配方,培養(yǎng)出高質(zhì)量金耳出菇菌袋[11,16]。

        99久久久精品免费| 国产av一区二区精品凹凸| 丝袜美腿一区在线观看| 白白色白白色视频发布| 欧美xxxx做受欧美| 国产亚洲美女精品久久久| 97色综合| 一区二区精品天堂亚洲av| 国产精品 无码专区| 国内揄拍国内精品人妻浪潮av | 欧美成人看片黄a免费看| 精品国产午夜久久久久九九| 中文字幕成人精品久久不卡91| 丰满人妻被两个按摩师| 亚洲av无码成人网站在线观看| 美女大量吞精在线观看456| 亚洲国产日韩在线精品频道| 日韩av在线亚洲女同| 日本少妇春药特殊按摩3| 精品欧美乱码久久久久久1区2区| 国产成人香蕉久久久久| 高清国产国产精品三级国产av| 国产综合色在线视频区| 日韩精品无码久久一区二区三| 久久久久无码精品国| 国产白浆一区二区在线| 国产成+人欧美+综合在线观看 | 玩弄丝袜美腿超短裙校花| 一本色道久久88加勒比综合| 色欲人妻aaaaaaa无码| 超薄肉色丝袜一区二区| 亚洲国产不卡av一区二区三区 | 国产成人久久777777| 亚洲成AV人片无码不卡| 人妻少妇猛烈井进入中文字幕| 久久成人国产精品免费软件| 日韩免费小视频| 日本高清在线一区二区三区| 国产色视频一区二区三区qq号 | 亚洲欧美一区二区三区国产精| 99热婷婷一区二区三区|