王樂強(qiáng)，徐麗娜，高程鵬，張翼翔，邱立潔

(濰坊市人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科,山東 濰坊）

0 引言

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系統(tǒng)最為常見的疾病之一，占所有老年人群發(fā)病率10～15%，最終進(jìn)展為呼吸衰竭和心力衰竭[1]。腦血管疾病已成為威脅全人類健康的首要疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率特點(diǎn)，其中70～85%為缺血性腦卒中。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年新發(fā)老年COPD合并缺血性腦卒中患者約 200～350萬，死亡率約 30～55%[2]。COPD 和缺血性腦卒中均是受遺傳和環(huán)境共同作用的多因素、多基因慢性疾病，微小RNAs（miRNAs）在調(diào)控疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能成為預(yù)防和治療疾病的重要靶點(diǎn)。采用基因測序技術(shù)檢測COPD患者循環(huán)血液中共有70多種miRNAs表達(dá)異常，缺血性腦卒中動物模型和在體臨床研究得出，約89個miRNAs表達(dá)明顯下調(diào)，35個明顯上調(diào)，并隨病情進(jìn)展表現(xiàn)一定的變化趨勢。在眾多的miRNAs中，miR-210表現(xiàn)的最為穩(wěn)定而顯著。miR-210與多種呼吸系統(tǒng)疾病，包括感染性肺炎、肺纖維化、哮喘、COPD、肺結(jié)核和腫瘤等均有密切關(guān)系。在缺血性腦卒中動物模型中證實(shí)[3]，miR-210在缺血/缺氧條件下，可參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)控、誘導(dǎo)血管新生、促進(jìn)神經(jīng)再生等?；诖?，該研究旨在分析miR-210在老年COPD合并缺血性腦卒中患者中的表達(dá)水平，并分析其作為敏感診斷指標(biāo)的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 對象資料

連續(xù)選擇2016年01月至2018年01月入我院60例老年COPD合并缺血性腦卒中患者（A組），60例單純老年COPD患者（B組），60例缺血性腦卒中患者（C組）和60例健康志愿者（D組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）COPD急性和穩(wěn)定期，缺血性腦卒中急性期；（2）年齡65～80歲；（3）入院治療前采集數(shù)據(jù)，完整可分析。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并肺部其他疾病，如肺癌、肺炎、哮喘、呼吸衰竭等，缺血性腦卒中穩(wěn)定期，其他腦源性疾病，如出血性腦卒中、腦腫瘤、腦炎等；（2）合并其他基礎(chǔ)疾病，如心、肝、腎等臟器功能障礙，自身免疫性疾病，全身感染性疾病，傳染性疾病等。

該研究取得我院倫理委員會通過及患者、家屬的知情同意權(quán)，其中A組男性26例，女性24例；年齡66～78歲，平均（72.3±10.2）歲；COPD病程1～8年，平均（4.2±2.5）年；COPD急性期24例，穩(wěn)定期 26例；缺血性腦卒中病程 0.5～3h，平均（1.3±0.6）h；合并高血壓12例，糖尿病6例，吸煙20例。B組男性25例，女性25例；年齡 68～79歲，平均（73.5±12.4）歲；COPD 病程 2～9年，平均（4.6±2.4）年；COPD急性期23例，穩(wěn)定期27例；合并高血壓13例，糖尿病5例，吸煙22例。C組男性24例，女性26例；年齡68～80歲，平均（73.6±12.5）歲；缺血性腦卒中病程 1.0～3.5h，平均（1.6±0.8）h；合并高血壓14例，糖尿病8例，吸煙16例。D組男性26例，女性24例；年齡67～80歲，平均（73.8±11.8）歲；合并高血壓16例，糖尿病7例，吸煙19例。組間的基線資料具有可比性。

1.2 研究方法

采用實(shí)時定量PCR法檢測外周血miR-210的表達(dá)水平，采用日本HI-801型便攜式肺功能儀檢測病情穩(wěn)定后的肺功能。

PCR 法主要儀器：9600 型 PCR 擴(kuò)增儀（美國 ABI 公司），RTPCR 檢測儀（美國 Bio-Rad 公司），BCM-8 超凈工作臺（北京六一廠），微量移液器（德國 Eppendorf 公司）。

主要步驟：抽取外周肘靜脈血5mL，3000g離心20min后-20℃保存待檢。應(yīng)用美國Invitrogen公司提供的AM1556試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計(jì)（美國 Bio-tek 公司）測定 RNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳測定 RNA 完整性。美國Media Cybernetics公司提供的TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 試劑盒合成cDNA，引物設(shè)計(jì)（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）：miR-210（F）：5’- TGCGGCTGTGCGTGTGACAG-3’，(R)：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’; 應(yīng)用小鼠 hsa-miR -16(5’-UA GCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’)作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系：1:20RT 產(chǎn)物 cDNA 5.0 μL+ 5 pmol/μL PCR 正負(fù)向引物各 0.5 μL+2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL 加水至 20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性 15 s、65 ℃ 退火 15 s、72 ℃ 延伸32 s，共40個循環(huán)，融解曲線分析溫度 60 ℃-95 ℃。結(jié)果以目的基因與內(nèi)參基因比值表示，采用2-⊿⊿Ct法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)；miR-210診斷的敏感性和準(zhǔn)確性采用受試者工作曲線（ROC）分析；P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組間miR-210水平的比較

A組的miR-210水平最低，其次為B組和C組，D組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

120例 COPD患者的肺功能結(jié)果顯示，F(xiàn)EV1/FVC＞0.7，F(xiàn)EV1≥ 0.8共 22例（肺 功 能 減 退 傾 向）；FEV1/FVC≤ 0.7，F(xiàn)EV1≥0.8共42例（輕度肺功能減退）;FEV1/FVC≤0.7，F(xiàn)EV1在0.5～0.8共 38例（中度肺功能減退）;FEV1/FVC≤0.7，F(xiàn)EV1在0.3～0.5共 12例（重度肺功能減退）;FEV1/FVC≤0.7，F(xiàn)EV1＜0.3共6例（特重度肺功能減退）。miR-210水平隨肺功能減退程度加重而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 組間miR-210水平的比較注：A組，老年COPD合并缺血性腦卒中；B組，老年COPD;C組，缺血性腦卒中；D組，健康志愿者）

圖2 不同肺功能的miR-210水平比較（1為C組和D組，2為肺功能減退傾向，3為輕度肺功能減退，4為中度肺功能減退，5為重度肺功能減退，6為特重度肺功能減退）

2.2 ROC曲線分析

以COPD為診斷標(biāo)準(zhǔn)，采用ROC曲線分析得出：miR-210的診斷敏感性85.6%，特異性72.6%，準(zhǔn)確性（曲線下面積）0.821,95%CI為0.632～0.924；以缺血性腦卒中為診斷標(biāo)準(zhǔn)，miR-210的診斷敏感性81.2%，特異性78.3%，準(zhǔn)確性0.802，95% CI為0.635～0.945，見圖 3。

圖3 miR-210診斷COPD和缺血性腦卒中的ROC分析

3 討論

miRNAs可以與目標(biāo)靶mRNA 3’ 端非翻譯區(qū)結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)沉默，在發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。COPD的發(fā)生與環(huán)境污染和吸煙密切相關(guān)，研究證實(shí)，miR-210在COPD患者中表達(dá)下調(diào)，增加PGE2的表達(dá)；在缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的誘導(dǎo)下，p53基因表達(dá)增強(qiáng)，miR-210表達(dá)降低，與HIF-1α呈正相關(guān)，調(diào)控AKT的失活[4]；p53基因可調(diào)控miR-210在DNA損傷反應(yīng)中的表達(dá)，抑制DNA修復(fù)過程[5]。通過該研究得出：COPD合并缺血性腦卒中組的miR-210水平最低，其次為COPD組和缺血性腦卒中組，健康志愿者組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析，miR-210水平隨肺功能減退程度加重而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC分析得出：miR-210診斷COPD的敏感性85.6%，特異性72.6%，準(zhǔn)確性0.821。證實(shí)，miR-210在COPD中表達(dá)下調(diào)，與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可作為疾病診斷的敏感性指標(biāo)。

缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展和神經(jīng)修復(fù)過程中，miR-210對細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)控可通過下調(diào)細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)，其中E2F3是直接靶點(diǎn)，在DNA復(fù)制的過程中E2F3調(diào)控細(xì)胞周期從G1過渡到S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖；此外，F(xiàn)GFRL1和HOXA1也是miR-210作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，HOXA1的過度激活可活化P44/42MAP激酶，促進(jìn)細(xì)胞增殖。miR-210可下調(diào)促凋亡半胱氨酸蛋白酶8（Caspase-8）的表達(dá)，提高間充質(zhì)干細(xì)胞的存活[6]。miR-210誘導(dǎo)血管新生依賴于Dicer基因的表達(dá)，miR-210是血管內(nèi)皮細(xì)胞存活、遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-210呈過表達(dá)，通過下調(diào)靶基因ephrinA3的表達(dá)促進(jìn)血管新生。研究證實(shí)，miR-210的表達(dá)水平與缺血性腦卒中的嚴(yán)重程度相關(guān)。miR-210促進(jìn)神經(jīng)再生的機(jī)制是通過抑制半胱天冬酶的活性來抑制神經(jīng)元的凋亡，調(diào)控bcl-2和bax水平的平衡[7]。通過該研究得出：COPD合并缺血性腦卒中組的miR-210水平比單純COPD和缺血性腦卒中更低，提示miR-210與COPD和缺血性腦卒中的發(fā)病均相關(guān)。ROC分析得出， miR-210診斷缺血性腦卒中的敏感性81.2%，特異性78.3%，準(zhǔn)確性0.802.提示，miR-210在缺血性腦卒中表達(dá)下調(diào)，可作為疾病診斷的敏感性指標(biāo)。

綜上所述，miR-210在COPD和缺血性腦卒中表達(dá)下調(diào)，可作為診斷COPD和缺血性腦卒中的敏感性指標(biāo)。