何 菲，先 春

（1.仁懷醬香白酒科研所，貴州 仁懷 564500；2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院 仁懷分院，貴州 仁懷 564500）

釀造醬香型白酒小麥中含有微量阿魏酸[1-2]，糯高粱中含有豐富的單寧物質(zhì)[3]，發(fā)酵過(guò)程中在微生物酶等諸多因素影響下逐步轉(zhuǎn)化為難揮發(fā)的多酚、半揮發(fā)性酚和揮發(fā)性酚，賦予了醬香型白酒獨(dú)特香氣和口味感官特征[4]。

由于這些酚類物質(zhì)中含有一個(gè)或多個(gè)酚羥基，具有一定的抗氧化作用和風(fēng)味貢獻(xiàn)，一直是酒界熱議的話題[5-6]。白酒的國(guó)內(nèi)外研究中，利用色譜類儀器檢測(cè)出了18種揮發(fā)性酚類物質(zhì)，如愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚等[7-9]；11種半揮發(fā)性酚類物質(zhì)，如香草醛、對(duì)羥基苯乙酮、水楊酸等[10]；27種難揮發(fā)的多酚類化合物，如沒(méi)食子酸、二氫黃酮、阿魏酸、槲皮素、楊梅酮等[11-13]。利用福林-酚法直接測(cè)定醬香酒的酚類總量及其變化規(guī)律等內(nèi)容則鮮有報(bào)道。

本研究利用酚類物質(zhì)在堿性條件下具有還原性，可將福林酚試劑中的磷鎢鉬酸還原成藍(lán)色，藍(lán)色深淺與酚類物質(zhì)的含量成正相關(guān)性原理[14]，利用分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定醬香型白酒中總多酚含量，選用沒(méi)食子酸作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品計(jì)算其總含量，探討分析不同醬香基酒和成品酒中總多酚的變化規(guī)律以及影響因素，并運(yùn)用IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行單因素方差分析，以期為今后的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒樣的收集

仁懷大曲醬香輪次基酒的采集。收集最近3年貴州仁懷境內(nèi)按照一年一個(gè)生產(chǎn)周期、兩次投糧、九次蒸煮、八次發(fā)酵、七次摘酒的傳統(tǒng)大曲醬香工藝生產(chǎn)的666個(gè)一至七輪次基酒（原酒），詳見(jiàn)表1。

表1 仁懷大曲醬香輪次基酒實(shí)驗(yàn)樣本信息Table 1 Experimental samples information of Renhuai Daqu sauce-flavor rounds base liquor

不同產(chǎn)地醬香工藝成品酒的采集。收集2018年出廠貴州仁懷境內(nèi)生產(chǎn)的傳統(tǒng)大曲醬香成品酒和其他非傳統(tǒng)大曲醬香成品酒201個(gè)酒樣；市場(chǎng)上，隨機(jī)購(gòu)買2018年出廠的12個(gè)非仁懷區(qū)域生產(chǎn)的醬香成品酒。詳見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地醬香成品酒實(shí)驗(yàn)樣本信息Table 2 Experimental samples information of sauce-flavor Baijiu from different producing areas

1.1.2 藥品與試劑

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：149-91-7，純度≥99.00%）：貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司；乙醇（色譜純）：默克股份兩合公司；鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰（均為分析純）：天津市津科精細(xì)化工研究所；溴水（Br2=3%，分析純）、磷酸（H3PO4≥85%，分析純）：成都市科龍化工試劑廠；鹽酸（36%～38%，分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水碳酸鈉（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901型雙束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BS 244S 電子天平：北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；10～100 μL、100～1 000 μL、1～10 mL移液器：艾德本（中國(guó)）有限公司；BWS-0510恒溫水槽與水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DK-98-11電子調(diào)溫萬(wàn)用爐：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

沒(méi)食子酸儲(chǔ)備液（100 mg/L）：精密稱取0.005 0 g（精確至0.000 1 g）沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)為60%vol的乙醇溶液溶解、定容至50 mL，4.0 ℃以下貯存。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液：準(zhǔn)確吸取沒(méi)食子酸儲(chǔ)備液1.60 mL于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液定容，得到16.0 mg/L標(biāo)液，然后依次吸取5.00 mL高濃度標(biāo)液于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液定容，依次得到16.0 mg/L、8.0 mg/L、4.0 mg/L、2.0 mg/L、1.0 mg/L、0.5 mg/L和0.0 mg/L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 試劑的配制

福林-酚（Folin-phenol）顯色試劑：分別稱取鎢酸鈉25.00 g（精確至0.01 g）、鉬酸鈉6.25 g（精確至0.01 g）于200 mL水中，完全溶解后轉(zhuǎn)入500 mL磨口三角瓶中，分別加入12.5 mL磷酸和25.0 mL鹽酸，攪拌混勻后置于100 ℃水浴鍋中回流2 h，再加入硫酸鋰37.50 g（精確至0.01 g）、適量的水和數(shù)滴溴水，敞開(kāi)置于電爐上使其沸騰15 min，使其溴水完全揮發(fā)；冷卻轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中定容，0.45 μm濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)入棕色瓶中備用[15]。

碳酸鈉溶液（75 g/L）：稱取無(wú)水碳酸鈉37.50 g（精確至0.01 g）溶于250 mL溫水中，攪拌混勻后轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中定容，0.45 μm濾膜過(guò)濾后置于常溫下備用[15]。

1.3.3 樣品的處理與計(jì)算

樣品測(cè)定條件的摸索：吸取兩個(gè)不同質(zhì)量濃度沒(méi)食子酸溶液（標(biāo)樣01和標(biāo)樣02）和兩個(gè)不同輪次基酒（酒樣01和酒樣02）1.0 mL，加入1.0 mL福林-酚顯色劑，振蕩后靜置3～5 min后，再加入8.0 mL 75 g/L碳酸鈉溶液后，在波長(zhǎng)765 nm條件下掃描沒(méi)食子酸溶液（掃描間隔0.5 min）；隨后掃描酒樣（沒(méi)食子酸標(biāo)樣溶液）在400～900 nm范圍內(nèi)的最大吸收波長(zhǎng)（掃描波長(zhǎng)間隔1 nm）[16]。

樣品含量的測(cè)定過(guò)程：吸取2.0 mL酒樣（或標(biāo)準(zhǔn)溶液）于25 mL比色管中，加入1.0 mL福林-酚顯色劑，振蕩后靜置3～5 min后，再加入7.0 mL 75 g/L碳酸鈉溶液，振蕩后靜置30.0 min后處理液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾取過(guò)濾液（或經(jīng)3 000 r/min離心5 min取上清液），在波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度值計(jì)算酒樣中總多酚的含量（以沒(méi)食子酸含量計(jì)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法的確認(rèn)

2.1.1 樣品取樣量、檢測(cè)波長(zhǎng)、顯色時(shí)間的確認(rèn)

圖2 酒樣（沒(méi)食子酸溶液）波長(zhǎng)掃描曲線Fig.2 Spectral scanning curve of Baijiu samples (gallic acid solution)

由酒樣（標(biāo)樣）處理液顯色時(shí)間掃描曲線（圖1）可知，酒樣01和酒樣02顯色30 min后溶液的吸光度值趨于平衡穩(wěn)定，標(biāo)樣01和標(biāo)02顯色30 min后吸光度值緩慢下降，實(shí)驗(yàn)確定處理液顯色30 min后立刻測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，隨后測(cè)定酒樣的吸光度值。由酒樣（標(biāo)樣）處理液光譜掃描曲線（圖2）可知，在波長(zhǎng)400～900 nm掃描范圍內(nèi)，酒樣01、酒樣02、標(biāo)樣01、標(biāo)樣02在波長(zhǎng)760 nm左右吸光度值達(dá)到頂峰，實(shí)驗(yàn)確定測(cè)定標(biāo)樣（酒樣）的波長(zhǎng)為760 nm。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性相關(guān)性

配制7個(gè)不同濃度梯度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，處理后顯色30 min后，在波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，先用2 cm比色皿盛空白溶液校零。以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.0621C-0.001，相關(guān)系數(shù)R2=1.000 0，說(shuō)明線性相關(guān)性較好。

2.1.3 方法精密度與準(zhǔn)確度

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可看出，平行試驗(yàn)6次沒(méi)食子酸溶液的測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.15%～1.53%，表明精密度良好，滿足相關(guān)技術(shù)要求。

表3 福林酚法的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision tests results of Folin-phenol method

2.1.4 樣品加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確吸取樣品2.0 mL于18支具塞比色管中，分成3個(gè)濃度組，每組分別添加1.026 mg/L、2.052 mg/L、5.130 mg/L沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法測(cè)定其吸光度值，進(jìn)行6水平試驗(yàn)計(jì)算其回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可看出，在選定的酒樣中成倍加入沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后，回收率分別為99.19%、101.53%和101.60%，回收率在90%～110%范圍內(nèi)，表明準(zhǔn)確度良好，滿足相關(guān)技術(shù)要求。

表4 福林酚法的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of standard recovery rate tests of Folin-phenol method

通過(guò)以上方法試驗(yàn)（標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法精密度、方法準(zhǔn)確度、方法回收率）的確認(rèn)，各項(xiàng)參數(shù)均滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》標(biāo)準(zhǔn)的附錄要求，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠[17]。

2.2 總多酚隨傳統(tǒng)工藝基酒輪次的變化比較

收集最近3年（2015-2016年度、2016-2017年度、2017-2018年度）仁懷境內(nèi)傳統(tǒng)醬香工藝生產(chǎn)的666個(gè)仁懷大曲醬香一至七輪次基酒測(cè)定其總多酚含量，利用IBM SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。以基酒的輪次作為因子，總多酚含量作為因變量進(jìn)行組間兩兩比較（表5），并繪制出波動(dòng)的箱線圖（圖3）。

由表5可知，通過(guò)仁懷傳統(tǒng)大曲醬香輪次基酒總多酚的組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，同類子集分析顯示除一輪次基酒和二輪次基的總多酚含量無(wú)明顯差異外，其他三輪次基酒、四輪次基酒、五輪次基酒、六輪次基酒、七輪次基酒的總多酚含量存在明顯差異。結(jié)合同類子集組間均值和箱線圖（見(jiàn)圖3）分析，總多酚的含量隨著基酒輪次的增加呈上升趨勢(shì)，除一、二輪次基酒變化不明顯外，其他輪次基酒總多酚含量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。

表5 仁懷大曲醬香輪次基酒總多酚含量的比較Table 5 Comparison of total polyphenols content in Renhuai sauce-flavor base liquor from different rounds mg/L

圖3 總多酚隨輪次變化的箱線圖Fig.3 Box plot of total polyphenols with rounds changes

通過(guò)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，仁懷本地釀酒企業(yè)按照TB52/RHJX 002—2015《仁懷大曲醬香酒生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范》標(biāo)準(zhǔn)選用富含單寧的本地優(yōu)質(zhì)糯高粱和小麥制得的高溫大曲作為主要釀造原料釀制生產(chǎn)取得一至七輪次基酒，其中特別要求高粱的單寧含量＞1.0%[18]。這些單寧物質(zhì)主要存在于高粱的果皮中，而發(fā)酵堆中的單寧酶能水解沒(méi)食子單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒(méi)食子酸和其他化合物[19]；同時(shí)，釀酒高粱果皮中含有豐富的游離態(tài)酚酸（如阿魏酸、丁香酸、沒(méi)食子酸等）和結(jié)合態(tài)酚酸（如阿魏酸、丁香酸等）[20]；另外，小麥麩皮中還含有微量的酚類物質(zhì)，小麥原料經(jīng)熱處理后酚類成分直線上升，其中以阿魏酸、香蘭醛、香蘭酸等為主[1]。又由于醬香傳統(tǒng)工藝采用循環(huán)發(fā)酵的模式進(jìn)行蒸餾取酒[18]，逐漸將原料果皮（麩皮）中酚類物質(zhì)酶解轉(zhuǎn)化到酒醅中，使得基酒中的總多酚含量隨著輪次的循環(huán)逐漸升高。

2.3 不同來(lái)源醬香酒總多酚的差異比較

收集（購(gòu)買）仁懷境內(nèi)生產(chǎn)201個(gè)不同醬香工藝的成品酒和非仁懷境內(nèi)生產(chǎn)12個(gè)具有代表性的醬香酒測(cè)定其總多酚含量，利用IBM SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。以工藝（產(chǎn)區(qū)）作為因子，總多酚含量作為因變量進(jìn)行組間兩兩比較（表6），并繪制出波動(dòng)的箱線圖（圖4）。

表6 不同來(lái)源醬香成品酒總多酚含量的比較Table 6 Comparison of total polyphenols in sauce-flavor Baijiu from different sources mg/L

圖4 不同工藝（產(chǎn)區(qū)）來(lái)源醬香成品酒總多酚箱線圖Fig.4 Box plot of total polyphenols in sauce-flavor Baijiu from different sources (producing areas)

由表6可知，通過(guò)不同來(lái)源醬香成品酒的總多酚的組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，子集2中仁懷境內(nèi)生產(chǎn)的碎沙工藝醬香成品酒、串香工藝醬香成品酒和非仁懷境內(nèi)生產(chǎn)的醬香成品酒之間的總多酚含量無(wú)明顯的差異；仁懷境內(nèi)生產(chǎn)的傳統(tǒng)工藝醬香成品酒略高于子集2中成品酒的總多酚含量，而仁懷境內(nèi)生產(chǎn)其他工藝醬香成品酒的總多酚含量明顯低于子集2和子集3中成品酒的總多酚含量。

通過(guò)調(diào)研勾兌工序發(fā)現(xiàn)，仁懷傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的醬香成品酒分別有一至七輪次基酒按一定的的比例勾兌調(diào)味后最終得到醬香成品酒[21]。一般情況下，勾兌時(shí)一至七輪次使用的比例依次分別為5%～10%、8%～15%、25%～35%、20%～30%、15%～20%、3%～10%、3%～10%，結(jié)合測(cè)定的一至七輪次基酒總多酚含量可發(fā)現(xiàn)，仁懷傳統(tǒng)工藝醬香酒的總多酚直接受勾兌比例和輪次基酒總多酚含量多寡的影響。另外，為了避免碎沙工藝、串香工藝醬香成品酒單薄、寡淡的風(fēng)格缺陷，勾兌師在這些工藝的半成品酒中加入傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的一輪次基酒，使酒味甜，放香好；加入傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的七輪次基酒，使酒的糊香好，只要不露頭，也增加了后味[22]，而七輪次基酒的總多酚含量相對(duì)較高，這樣直接導(dǎo)致仁懷境內(nèi)生產(chǎn)的碎沙工藝、串香工藝醬香成品酒中總多酚含量的升高。

通過(guò)調(diào)研收集的214個(gè)酒樣釀造原料和工藝現(xiàn)狀發(fā)現(xiàn)，非仁懷境內(nèi)生產(chǎn)的醬香成品酒使用的釀酒高粱的單寧相對(duì)仁懷本地糯高粱的單寧含量要低[23-24]；而仁懷傳統(tǒng)工藝按照標(biāo)準(zhǔn)要求選用本地種植的優(yōu)質(zhì)糯高粱，單寧含量相對(duì)較高[25]；仁懷碎沙工藝多選用相對(duì)便宜的北方糯高粱，這類高粱通常單寧含量相對(duì)較低[26]；仁懷串香工藝醬香成品酒以食用酒精為原料，串蒸傳統(tǒng)工藝8次發(fā)酵后的丟糟粗糙制得；仁懷其他工藝醬香酒則直接在食用酒精中添加香精香料，并加入少量過(guò)剩的傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的一輪次基酒、七輪次基酒和窖底味酒，簡(jiǎn)單勾兌調(diào)味而成。從原料的使用情況看，原料中的單寧含量存在不同程度的差異，間接影響不同來(lái)源醬香成品酒中的總多酚含量。

3 結(jié)論

基于紫外吸光度值與醬香酒中總多酚含量的正比關(guān)系，在0.50～16.00 mg/L范圍內(nèi)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好（R2=1.000），精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD范圍為0.15%～1.53%，加標(biāo)回收率范圍為99.19%～101.60%，說(shuō)明樣品處理過(guò)程時(shí)，總多酚的損失和變化可忽略不計(jì)，驗(yàn)證該方法準(zhǔn)確可靠，適合用于測(cè)定醬香酒中的總多酚的含量。

通過(guò)同類子集比較結(jié)合生產(chǎn)調(diào)研分析，仁懷大曲醬香輪次基酒中的總多酚主要受原料中單寧等酚類物質(zhì)含量和蒸煮發(fā)酵循環(huán)次數(shù)的影響，促使蒸餾取得的傳統(tǒng)工藝輪次基酒的總多酚含量呈上升的趨勢(shì)；另外，受勾兌和基酒的影響，仁懷傳統(tǒng)工藝醬香成品的總多酚含量略高于別的醬香成品酒。通過(guò)分析測(cè)定醬香傳統(tǒng)工藝輪次基酒和不同來(lái)源醬香成品酒中總多酚含量，可為醬香酒的勾兌調(diào)味和工藝（產(chǎn)區(qū)）識(shí)別提供數(shù)據(jù)參考。同時(shí)，為貯存時(shí)間、貯存環(huán)境、貯存容器等影響因素的探討奠定基礎(chǔ)。